Estudios experimentales sobre el efecto inmunomodulador de la cistatina de Ascaris lumbricoides

Abstract

Las enfermedades inflamatorias crónicas no transmisibles (ECNT) son un grupo clínicamente heterogéneo de entidades cuya prevalencia va en aumento a nivel mundial y comparten vías inflamatorias comunes resultantes de la combinación de factores genéticos y ambientales. Algunas enfermedades incluidas en este grupo son la diabetes, desordenes autoinmunes, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la enfermedad inflamatoria intestinal, el asma y las alergias, aunque cada una de ellas con características clínicas diferentes. En la última década se ha propuesto el estudio y la evaluación de productos derivados de parásitos helmintos como alternativa terapéutica potencial para el tratamiento de algunas enfermedades inflamatorias. Los helmintos son organismos multicelulares con estilo de vida parasítico en el cual han desarrollado la capacidad modular el sistema inmune de sus hospederos mamíferos a un estado de supresión, creando un entorno favorable a su supervivencia; principalmente mediante la excreción/secreción (E/S) de moléculas con actividad inmunomoduladora o antinflamatoria. Para el caso de Ascaris lumbricoides, que es el causante de la helmintiasis más común en mundo y la más prevalente en humanos, hay muy poca información sobre los mecanismos inmunomoduladores de sus productos de E/S. A la fecha se sabe que secreta la proteína PAS1, la cual en modelos murinos modula la inflamación y el asma alérgica a través de la inducción de células T reguladoras (Tregs), también se ha demostrado un efecto supresor del extracto del gusano adulto sobre la respuesta celular y humoral en varios modelos animales de inflamación; y que el líquido pseudocelomico del parasito suprime la inflamación mediante alteración de la función de células dendríticas y macrófagos. 7 A. lumbricoides también produce una cistatina (inhibidor de cisteína proteasas o Al CPI) altamente homologa a las de otros helmintos con actividad inmunomoduladora. La cistatina de A. lumbricoides es una proteína de 14.6 kD de la cual ni la respuesta inmune ni sus propiedades inmunomoduladoras habían sido estudiadas, por lo que en esta tesis se exploraron estos aspectos usando la cistatina recombinante (rAl CPI). Inicialmente se determinaron las características de actividad bioquímica y estructurales de rAl-CPI y se realizaron pruebas in vitro de citotoxicidad, se describió la respuesta de citoquinas en una línea celular de macrófagos peritoneales de ratón, células THP-1blue y células dendríticas derivadas de monocitos humanos (HmoDCs). También se evaluó la presencia de anticuerpos IgE e IgG4 específicos contra rAl-CPI en muestras de suero de individuos humanos expuestos y sensibilizados a A. lumbricoides y la capacidad de rAl-CPI de activar basófilos o estimular la liberación de histaminas en muestras sanguíneas de individuos con IgE específica a ella. Los estudios in vivo correspondieron al análisis de toxicidad aguda, de alergenicidad mediante un modelo de anafilaxia cutánea pasiva (PCA) y de descripción de la respuesta inmune en ratones BALB/c. El efecto inmunomodulador se estudió usando dos modelos murinos de inflamación: uno de colitis aguda inducida por dextran sulfato de sodio (DSS) y uno de asma alérgica inducida por el extracto del acaro del polvo doméstico (HDM) Blomia tropicalis. Los resultados indicaron que la rAl-CPI producida posee estructuras secundarias de plegamiento y tiene actividad inhibidora de las cisteína proteasas. In vitro rAl-CPI no es citotóxica y estimula a los macrófagos murinos a producir altos niveles de IL 10 y TGFβ. En las células THP1-blue se observa activación de manera similar que con los ligandos del TLR4, mientras que el efecto sobre las HmoDCs es la inhibición 8 de la expresión de las moléculas de superficie marcadoras de maduración HLA-DR, CD83 y DC86. Aunque in vitro rAl-CPI es reconocida por la IgE humana, no se observó que cause activación de basófilos o liberación de histamina. En los ratones, rAl-CPI no es toxica según los parámetros evaluados y no induce PCA. Por otro lado, rAl-CPI estimula el sistema inmune favoreciendo el desarrollo de la respuesta Th1, un efecto importante observado es la producción de IL-10 y la estimulación de Tregs. En el modelo de colitis inducida por DSS se observó que el índice de severidad de la enfermedad, los marcadores macroscópicos, microscópicos e inmunológicos de la inflamación disminuyeron significativamente en los animales tratados preventivamente con rAl-CPI. También se detectaron más linfocitos Tregs y macrófagos productores de IL-10 en los ganglios linfáticos mesentéricos (MNL) de los ratones tratados que en los del grupo control enfermo. En el modelo de asma alérgica se encontró que la rAl-CPI protegió a los ratones del desarrollo de la inflamación de las vías aéreas inducida por extracto de B. tropicalis (BtE). El porcentaje de eosinófilos y los niveles de citoquinas Th2 en lavado broncoalveolar (BAL) fueron significativamente menores en los ratones tratados preventivamente que en los controles asmáticos, mientras que la producción de IL 10 y TGF-β se observó aumentada. Se observó un efecto importante en cuanto a la producción de anticuerpos, en los animales tratados con rAl-CPI se evidenció un cambio en la producción de IgE a IgG en particular IgG2a específica a B tropicalis. La administración del anticuerpo monoclonal bloqueante del receptor de IL-10 (anti IL10R) llevo a una disminución significativa en el porcentaje de Tregs en bazo en comparación con el control de isotipo y cierto grado de modificación del efecto preventivo de rAl-CPI sobre la respuesta humoral.