Efectos inmunomoduladores de la cistatina de Ascaris lumbricoides sobre los linfocitos B

Abstract

La actividad aberrante de los linfocitos B se ha asociado con distintas enfermedades autoinmunitarias como la artritis reumatoide (AR) (1). Esta enfermedad se caracteriza por tener un fuerte componente inflamatorio por lo que han sido distintos los mecanismos estudiados para crear dianas terapéuticas. Las cistatinas helmínticas han demostrado tener efectos antiinflamatorios en modelos de inflamación como la AR experimental. rAlCPI, una cistatina helmíntica, ha demostrado un papel inmunorregulador en modelos inflamatorios. Uno de los mecanismos por medio del cual lo hace es a través de la inducción de la citoquina antiinflamatoria IL-10. Hasta ahora se desconoce el papel de rAl-CPI en la inducción de IL-10 en los linfocitos B de donadores sanos y pacientes con AR. En este estudio se analizó la inducción de IL-10 por parte de linfocitos B purificados de PBMCs de donadores, y pacientes con AR pareados con controles por edad y sexo frente a la estimulación con rAl-CPI. Durante la selección de la concentración de rAl-CPI adecuada para realizar las estimulaciones de todos los experimentos, se encontró que la concentración 0,1 µM indujo los mayores niveles de IL-10 en comparación con las otras concentraciones (1 µM, 0,01 µM, 0,001 µM). Para averiguar si los bajos niveles de IL-10 en la concentración 1 µM se debieron a efectos citotóxicos, se realizaron estudios de viabilidad de PBMCs y linfocitos B con los marcadores FVD y Anexina-V + yoduro de propidio frente a las cuatro concentraciones de rAl-CPI utilizadas. Se encontró que rAlCPI 1 µM fue citotóxica para los linfocitos B de donadores sanos, a diferencia de la concentración de rAl-CPI 0.1 µM. Posteriormente, cuando se evaluaron los niveles de IL10 en sobrenadantes de PBMCs provenientes de donadores sanos mediante ELISA se encontraron unos niveles más altos en la condición estimulada con rAl-CPI 0.1 µM comparada con la condición control (p=0,012). Para verificar la inducción en linfocitos B de marcadores asociados a Bregs, las PBMCs de los donadores sanos fueron sometidas a tinción de marcadores de superficie e intracelular (CD25, CD1d, CD71, CD73, CD5 e IL.10). Se encontró un descenso estadísticamente significativo en la expresión del marcador CD25 en la condición rAl-CPI 0.1 µM + CpG comparada con CpG (p=0.037), mientras que no se hallaron diferencias significativas en los demás marcadores. Después, se midieron los niveles de IL-10 en los sobrenadantes de linfocitos B purificados de PBMCs de donadores sanos mediante ELISA y se encontraron unos niveles más altos en la condición estimulada con rAl-CPI comparada con la condición control (p=0,0037). Posteriormente, se compararon los niveles de IL-10 en los sobrenadantes de linfocitos B purificados de pacientes con AR y sus controles pareados mediante ELISA, encontrándose diferencias significativas en los niveles de IL-10 cuando se comparó la condición RPMI entre los grupos (p=0,034). La medición de IL-10 e IL-6 mediante CBA no arrojó diferencias significativas cuando se comparó entre las condiciones y grupos. En conclusión, se demuestra que las altas concentraciones de rAl-CPI son citotóxicas para la subpoblación de linfocitos B. La estimulación con rAl-CPI sugiere que es capaz de inducir producción de IL-10 en linfocitos B de donadores sanos. Esta tendencia no fue tan clara en el grupo de casos y controles. La inducción de linfocitos B reguladores no es concluyente de acuerdo a las mediciones de marcadores de superficie e intracelulares. Se sugiere la realización de estos experimentos con otras técnicas de purificación de linfocitos B, así como un aumento en el tamaño de la muestra.