Evaluación de los efectos inmunomoduladores de la cistatina de Ascaris lumbricoides sobre poblaciones celulares humanas

Abstract

Los helmintos modulan el sistema inmunológico del hospedero infectado de diversas maneras, incluyendo mecanismos inmunomoduladores que disminuyen la respuesta inflamatoria y aumentan la longevidad del parásito [1]. Se han aislado varias moléculas inmunomoduladoras derivadas de helmintos que han mostrado ser agentes antiinflamatorios prometedores. Dentro de estas se encuentra la cistatina de A. lumbricoides (Al-CPI), una molécula que reduce en ratones la colitis experimental [2] y la inflamación bronquial en un modelo de alergia inducido por Blomia tropicalis [3]. De forma general se observaron efectos preventivos de la inflamación, acompañados por una alta producción de IL-10 y TGF-β y aumento de los linfocitos T reguladores Foxp3+ [2]. También se publicaron experimentos en células dendríticas humanas que sustentan la generación de un perfil tolerogénico [3], en esta población de gran importancia en la modulación de la respuesta inmune tanto de forma fisiológica como en la patogénesis del asma y otras condiciones. Dentro de las preocupaciones actuales en esta línea de investigación, estaba la necesidad de tener un producto recombinante que se obtuviera en mayores cantidades y libre de endotoxina. También mejorar su estabilidad y optimizar su purificación, dado que todos estos aspectos (contaminantes, aminoácidos extras) pudieran influir en la evaluación inmunológica de sus propiedades. Teniendo en cuenta que uno de los propósitos finales de esta investigación es generar un producto de utilidad clínica para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, especialmente el asma, se buscó a través de este trabajo de grado contribuir a la optimización de la producción de una cistatina recombinante de Ascaris y a evaluar su efectos en la activación de varias poblaciones celulares que participan en el desarrollo de la respuesta alérgica y que se predice que pueden ser blanco de la cistatina de acuerdo a otros hallazgos con moléculas similares [4, 5]. Siguiendo esta línea, en primer lugar, se expresó una nueva recombinante de rAl-CPI, la cual no posee el péptido señal y presenta pocos aminoácidos, en la cepa de E. coli BL21(DE3). La proteína se obtuvo con un buen rendimiento (4.5 mg por cada 100 mL de cultivo), además, se purificó de manera eficiente mediante la técnica de intercambio aniónico obteniéndose una pureza del 99% y niveles de endotoxina por debajo de 0.1 EU/mL, después de tratada con polimixina B. Posteriormente, se evaluó el efecto de rAl-CPI sobre células dendríticas derivadas de monocitos (CDmo) y monocitos a nivel de marcadores de superficie y producción de citoquinas; y segundo los efectos de esta molécula en la respuesta de los linfocitos T CD4+ ante B. tropicalis y un estímulo policlonal (antiCD2/3/28). Para esto, se realizó un estudio experimental, en el cual se extrajeron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) provenientes de controles no alérgicos, no parasitados y de pacientes alérgicos a B. tropicalis, siguiendo estándares éticos. Los resultados muestran que rAl-CPI puede inhibir la maduración inducida por LPS de las CDmo y los monocitos, además, de disminuir la producción de citoquinas inflamatorias. Estos efectos variaron de acuerdo con la dosis utilizada de rAl-CPI en CDmo, mientras que a la dosis de 1 µM hubo una reducción significativa de los marcadores HLA-DR, PD-L1 y CD86, fue a la dosis de 0.1 µM donde se pudo obtener resultados significativos en la reducción de citoquinas inflamatorias (IL-6, IL-8 y TNF). En monocitos, la reducción en la expresión de los marcadores HLA-DR y PD-L1 y los niveles de las citoquinas IL-1β e IL-10 inducida por LPS se observó a la dosis de 1 µM de rAl-CPI. Los efectos inmunomoduladores de rAl-CPI también se pudieron apreciar en la respuesta de los linfocitos T CD4+. En cultivos de PBMC provenientes de pacientes y controles, rAl-CPI inhibió la proliferación de los linfocitos T CD3+CD4+ estimulados con anti-CD2/3/28 acompañado de una disminución en la producción de IL-5 y un aumento de IFN-γ, sin cambios en los niveles de IL-10. Este resultado fue independiente del efecto que tiene rAl-CPI en monocitos y células dendríticas, dado que un efecto similar se observó en linfocitos T CD3+CD4+ purificados. Asimismo, rAl-CPI disminuyó significativamente la producción de IL-5 e IL-10 inducida por B. tropicalis en PBMC de pacientes alérgicos. En conclusión, rAl-CPI tiene efectos inmunomoduladores en células dendríticas derivadas de monocitos, en monocitos de sangre periférica y en la respuesta inmune de linfocitos T CD4+ hacia B. tropicalis y estímulos policlonales que podrían reducir la intensidad de la respuesta inflamatoria de tipo alérgico, posiblemente por mecanismos independientes de la IL-10.