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Allergenic activity of Glutathione Transferase derived from Blomia tropicalis (Blo t 8)

Bustillo Arias, Juana | 2018

BACKGROUND: The prevalence of allergic diseases has increased worldwide. Blomia tropicalis is a mite of allergenic importance in tropical and subtropical areas. Few allergens from this source have been fully characterized and there is a need to gain a deep insight on the immunological response to its components due to its clinical and academic implications. It has been previously reported that Blo t 8, the glutathione transferase of this mite, has allergenic properties. However, the influence of sensitization on asthma presentation remained unknown. METHODS: The IgE-binding capacity of recombinant Blo t 8 (rBlo t 8) was evaluated by indirect ELISA in 574 subjects living in three different locations of the Department of Bolivar. The asthma case-control study involved 183 asthmatic patients and 200 non-asthmatic controls living in Santa Catalina or Cartagena. Additionally, we compared in 191 subjects the specific IgE response to Blo t 8 between two matched groups of African-descendent subjects (with parents and grandparents born in Palenque) who lived in this rural (93) town or in the urban (91) city of Cartagena. Additionally, we tested if Blo t 8 was able to induce airways inflammation. Three groups of BALB/c mice (n = 6 each) were sensitized i.p. and challenged i.n. with: 1.Alum-adsorbed Blo t 8, 2. phosphate buffer + alum (as negative control) or Alumadsorbed ovalbumin (as positive control). Total and allergen-specific IgE, IgG1 and IgG2a antibodies were measured. The allergenic potential of Blo t 8 was also evaluated in a mouse model of passive cutaneous anaphylaxis and human basophil activation test. RESULTS: Blo t 8 sensitization was higher in controls than in asthmatic patients (64,4% versus 23,9%, respectively). After adjustment by several potential confounders, Blo t 8 sensitization kept as a protective factor for asthma (aOR: 0.1 95%CI: 0.05-0.17). In the two related populations of Palenque origin, it was observed that Blo t 8 specific IgE response was more intense in the rural environment. In regard to the observed results in mice, Blo t 8 induced total and specific IgE roduction; however, contrary to OVA, it did not induce airway inflammation. In regard to the PCA results, the allergenic potential was intermediate, being the highest for OVA and negative for PBS. CONCLUSION: The epidemiological relationship of rBlo t 8 with asthma presentation was in a protective direction. In contrast to classical allergens, sensitization to rBlo t 8 did not induce features of airway inflammation in experimentally sensitized animals.

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Análisis de la actividad alergénica de rBlo t 13, un alergeno recombinante del ácaro blomia tropicalis

Donado Rangel, Karen Lorena | 2021

Los ácaros del polvo doméstico son desencadenantes de manifestaciones alérgicas. Entre estos, Blomia tropicalis es una de las especies más abundantes en las regiones tropicales y subtropicales. Pocos de sus alergenos se han caracterizado completamente. La frecuencia de sensibilización IgE se ha utilizado como referente para establecer la importancia clínica de los alergenos sin considerar otros aspectos que pueden ser importantes para el desarrollo de una respuesta inflamatoria alérgica. El objetivo de esta tesis fue analizar la actividad alergénica de la proteína recombinante Blo t 13 (rBlo t 13) derivada del ácaro B. tropicalis. Para esto rBlo t 13 se produjo en E. coli, se purificó mediante cromatografía de afinidad con resina de níquel y se obtuvo con bajos niveles de endotoxina. La actividad alergénica de rBlo t 13 se analizó mediante la asociación entre la frecuencia de reactividad IgE y la presentación de asma en un estudio de casos y controles, pruebas de activación de basófilos indirecta, evaluación de la inflamación de las vías respiratorias en ratones Balb/c mediante la reactividad bronquial al reto con metacolina, análisis del contenido de células inflamatorias en lavado broncoalveolar e histología del tejido pulmonar, determinación de anticuerpos IgG1, IgG2a e IgE contra rBlo t 13 y la prueba de anafilaxia cutánea pasiva en ratones Balb/c. En este estudio no se encontró asociación entre la frecuencia de reactividad IgE a rBlo t 13 y la presentación de asma. No se observó hiperreactividad bronquial al reto con metacolina en los ratones tratados con rBlo t 13. Sin embargo, en estos ratones el número de eosinófilos en el lavado broncoalveolar (BAL), el infiltrado inflamatorio pulmonar, la producción de moco por las células caliciformes y la producción de anticuerpos IgG1 e IgE específicos fueron significativamente mayor a lo observado en los ratones tratados con buffer fosfato salino (PBS). La prueba de anafilaxia cutánea pasiva fue negativa. Este estudio sugiere que rBlo t 13 tiene capacidad de inducir inflamación de tipo Th2, lo cual sustenta que tiene actividad alergénica

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Análisis de la respuesta de linfocitos T estimulados con una proteína híbrida derivada de alérgenos de ácaros domésticos

Pérez Castillo, Jahaziel | 2018

Este proyecto de investigación tiene la finalidad, determinar si la proteína híbrida DPx4 derivada de ácaros domésticos induce la activación de linfocitos T de pacientes alérgicos.

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Efecto de las parasitosis intestinales en la presentación y severidad de artritis reumatoide y su impacto en linfocitos T y B reguladores

López Crespo, Juan Felipe | 2019

Las enfermedades autoinmunes son condiciones de difícil tratamiento asociadas a alta discapacidad, afectación de la calidad de vida y un alto costo para su manejo (1). La etiología de estas entidades aún es desconocida, pero se sabe que son resultado de la interacción entre factores genéticos, desequilibrio en la regulación del sistema inmune y detonantes medio ambientales(2). Se ha planteado que las parasitosis intestinales pueden ejercer un papel protector en el desarrollo de EA. El presente proyecto analizó el efecto de la infección por parásitos intestinales en la presentación y severidad de enfermedades autoinmunes de tipo sistémico. Además se estudiaron poblaciones celulares reguladoras asociadas a autoinmunidad y el impacto de las parasitosis sobre estas. Se llevó a cabo un estudio de casos (AR n=31; LES n=21) y controles (n=87) pareados por edad, sexo, zona de residencia y estrato socioeconómico para evaluar la relación entre la infección por parásitos intestinales y la presentación de dos enfermedades autoinmunes (artritis reumatoide y lupus eritematoso sistémico). El estado parasitario se determinó a través de un análisis coprológico. La fase epidemiológica, encontró un posible nexo inverso entre la condición de autoinmunidad y las parasitosis intestinales por protozoarios (ORajustado: 0,27; IC95%: 0,07 - 0,99, p = 0,049). Debido a la baja frecuencia de helmintiasis, se evaluó la respuesta IgE frente a Ascaris lumbricoides, un helminto de alta prevalencia en el trópico. En contraste con el hallazgo inicial, la frecuencia e intensidad de la respuesta IgE determinada por ELISA frente al helminto fue mayor en casos que en controles, además la sensibilización a Ascaris estuvo asociada directamente con la AR (ORajustado: 3,9; IC95%: 0,16 – 12,05, p = 0,049). En un subgrupo de participantes (AR: n = 25 y controles sanos: n = 24) se les solicitó una muestra de sangre para determinación de citoquinas, la frecuencia y actividad funcional de linfocitos B y T reguladores por citometría de flujo y se relacionaron estas variables con la presentación o severidad de la enfermedad. La actividad de la enfermedad fue evaluada a través de escalas clínicas (DAS-28 y HAQ). Se detectaron concentraciones séricas significativamente más altas de IL-8 (5,8 vs 4,7 pg/mL; p=0,037) e IL-6 (8,6 vs 2,6 pg/mL; p=0,005) en los pacientes con AR en comparación con los controles. Las concentraciones de las citoquinas se relacionaron con uso de corticoides orales (Beta: 1,59; ES: 0,81; p = 0,049) y agentes antirreumáticos modificadores de la enfermedad o FARME (Beta: 1,43; ES: 0,78; p = 0,067) en el caso de la IL-8 y con la presentación de artritis reumatoide en el caso de la IL-6 (Beta: 0,81 ES: 0,40, p = 0,046). La población de células B reguladoras CD19+CD25+CD71+CD73- presentaron mayor frecuencia en los controles sanos en comparación con los pacientes con AR (23,4% vs 15,8%, p=0,008). No se encontraron diferencias en la funcionalidad de las poblaciones de linfocitos B productores de IL-10. Las poblaciones de Bregs se correlacionaron negativamente con los niveles séricos de citoquinas inflamatorias (TNF-α, IL-6, IL8) y con parámetros de severidad (HAQ y articulaciones inflamadas). Las frecuencias de CD19+CD25+CD71+CD73- fueron más altas en los infectados por protozoarios; sin embargo, un modelo multivariado se encontró que estas estaban más relacionadas con la condición de autoinmunidad (Beta=-6,4; ES: 0,78; p=0,042). No hubo hallazgos del efecto de la severidad o el tratamiento sobre las Bregs. Las frecuencias de Tregs definidas por el fenotipo CD25+CD127low/- fueron mayores en los controles que en los casos y se correlacionan con la frecuencia de linfocitos B productores de IL-10 (B10). Finalmente, las citoquinas en los cultivos de PBMCs de pacientes y controles no exhibieron diferencias y la IL-10 se correlaciona positivamente el resto de las citoquinas inflamatorias. En conclusión, en este estudio se observó una relación inversa entre la presentación de enfermedades autoinmunes y la presentación de infección por protozoarios intestinales. Así mismo, se encontraron poblaciones celulares relacionadas con mecanismos de tolerancia (Bregs y Tregs) asociados con protección de artritis reumatoide. Es posible que la infección por parasitosis intestinales se asocie a una mayor frecuencia de Bregs, pero esto debe seguir estudiándose.

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Effects of Ascaris lumbricoides in eosinophils, regulatory B cells and asthma severity in asthmatic patients from a helminth endemic population

Peñaranda Garcia, Daniel | 2019

Background: Helminth infections can modify the immune response of the host and exert risk and protective effects on allergic diseases depending on the chronicity and intensity of the infection. Blood populations such as eosinophils and regulatory B cells have been independently associated with helminth infection and allergic diseases, with eosinophils being used as biomarkers for severity. However, the effects of helminth infections in these blood populations, and the predictive role of eosinophils in asthma severity is unclear in humans from endemic settings. Objectives: To characterize the effects of Ascaris lumbricoides infection in eosinophils, regulatory B cells and asthma severity in asthmatic patients from a helminth endemic population. Methods: In a rural community from the Colombia tropics, asthmatic patients were recruited and evaluated with a clinical questionnaire, specific and total IgE, complete blood counts, skin prick test, serial coprologicals and spirometry. Regulatory B cell subsets were evaluated in a subset of asthmatic patients and controls from the community. Results: A total of 82 patients with wheezing symptoms in the last year were recruited. Complete blood counts showed a mean eosinophil count of 654 (±SD 634) cells/uL, with 48,7% (n=40) of patients having eosinophils greater than 400 cells/uL. The frequency of active A.lumbricoides and T.trichiura infection were 46,3% (n=38) and 18,2% (n=15) respectively. In the multivariate analysis, A.lumbricoides sensitization was associated with a 6.9-fold increase in the odds of having eosinophils greater than 400 cells/uL (p=0.002) and House Dust Mite (HDM) sensitization was also associated with a 5,4-fold increase (p=0.008). Helminth infection was associated with higher log-transformed eosinophils independently of age and HDM sensitization.We found lower percentage of CD24+CD38+ B cells in asthmatic patients compared to control subjects and no significant differences between infected and uninfected patients for CD1dhighCD5+ and CD24highCD38high B cell subsets. Conclusion: In a rural community from the Colombian tropics, where helminths are endemic, sensitization to A.lumbricoides was more predictive of eosinophilia than sensitization to house dust mites. The frequency of regulatory B cell subsets was lower in asthmatic patients than in controls. Further research should evaluate larger cohorts and determine the basal level of eosinophils in this population and focus on the cellular function of regulatory B cells.

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Estandarización de técnicas experimentales para la evaluación de la actividad eosinofílica en respuesta a Ascaris spp

Varela Coneo, Eskarly | 2021

Las infecciones por helmintos se consideran un problema de salud pública a nivel mundial, dado que, aunque estos organismos casi nunca generan mortalidad, los índices de morbilidad son bastante elevados, generando grandes costos en los sistemas de salud, sobre todo en poblaciones endémicas, gracias a su capacidad para manipular y suprimir el sistema inmune del hospedero y generar infecciones crónicas. Durante varios años, el Instituto de Investigaciones Inmunológicas, ha venido estudiando la relación inmunológica entre las células del sistema inmune y los nematodos endémicos de la región caribe colombiana, dadas las bajas condiciones socioeconómicas y sanitarias en diversas poblaciones. Teniendo como base la hipótesis de que los eosinófilos son claves en la respuesta frente a la infección por helmintos y tomando como base de estudio los resultados encontrados en poblaciones rurales cercanas a Cartagena de indias, hemos querido identificar herramientas para estudiar si el eosinófilo es capaz de atacar directamente al nematodo Ascaris spp en estado larvario y los eventos de activación que ocurren en la célula al exponerse a ellas o a través del reconocimiento de sus productos secretados. Para esto, se estandarizó la técnica de incubación de huevos de Ascaris suum para obtener larvas en estadio L3. Se evaluó la técnica de purificación magnética de eosinófilos humanos a partir de sangre periférica (“Eosinophil Isolation Kit human” #130-092-010, Miltenyi Biotech, Alemania), obteniéndose eosinófilos purificados por citometría de flujo y microscopio óptico con un 60% de pureza. Se estudió la actividad larvicida in vitro de los eosinófilos purificados frente a Áscaris spp y sus antígenos representativos, encontrándose que los eosinófilos de sangre periférica humanos, en presencia de anticuerpos IgE, incubados con larvas L3 de Ascaris suum, fueron capaces de adherirse masivamente a las paredes de la larva, pero no se obtuvieron resultados concluyentes sobre la viabilidad de las larvas. Adicionalmente, se observó liberación de proteína citotóxica peroxidasa del eosinófilo (EPO) en presencia del recombinante rABA-1 y de suero de pacientes con IgE a este antígeno. Se evaluó una estrategia de medición de activación de eosinófilos basada en el anticuerpo monoclonal CD69, encontrándose una mayor expresión de CD69 en presencia de ABA-1 y con la adición de sueros positivos a ABA-1, pero no en sueros IgE negativa a ABA-1.

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Evaluación de los efectos inmunomoduladores de la cistatina de Ascaris lumbricoides sobre poblaciones celulares humanas

Lozano Mendoza, Ana Milena | 2019

Los helmintos modulan el sistema inmunológico del hospedero infectado de diversas maneras, incluyendo mecanismos inmunomoduladores que disminuyen la respuesta inflamatoria y aumentan la longevidad del parásito [1]. Se han aislado varias moléculas inmunomoduladoras derivadas de helmintos que han mostrado ser agentes antiinflamatorios prometedores. Dentro de estas se encuentra la cistatina de A. lumbricoides (Al-CPI), una molécula que reduce en ratones la colitis experimental [2] y la inflamación bronquial en un modelo de alergia inducido por Blomia tropicalis [3]. De forma general se observaron efectos preventivos de la inflamación, acompañados por una alta producción de IL-10 y TGF-β y aumento de los linfocitos T reguladores Foxp3+ [2]. También se publicaron experimentos en células dendríticas humanas que sustentan la generación de un perfil tolerogénico [3], en esta población de gran importancia en la modulación de la respuesta inmune tanto de forma fisiológica como en la patogénesis del asma y otras condiciones. Dentro de las preocupaciones actuales en esta línea de investigación, estaba la necesidad de tener un producto recombinante que se obtuviera en mayores cantidades y libre de endotoxina. También mejorar su estabilidad y optimizar su purificación, dado que todos estos aspectos (contaminantes, aminoácidos extras) pudieran influir en la evaluación inmunológica de sus propiedades. Teniendo en cuenta que uno de los propósitos finales de esta investigación es generar un producto de utilidad clínica para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, especialmente el asma, se buscó a través de este trabajo de grado contribuir a la optimización de la producción de una cistatina recombinante de Ascaris y a evaluar su efectos en la activación de varias poblaciones celulares que participan en el desarrollo de la respuesta alérgica y que se predice que pueden ser blanco de la cistatina de acuerdo a otros hallazgos con moléculas similares [4, 5]. Siguiendo esta línea, en primer lugar, se expresó una nueva recombinante de rAl-CPI, la cual no posee el péptido señal y presenta pocos aminoácidos, en la cepa de E. coli BL21(DE3). La proteína se obtuvo con un buen rendimiento (4.5 mg por cada 100 mL de cultivo), además, se purificó de manera eficiente mediante la técnica de intercambio aniónico obteniéndose una pureza del 99% y niveles de endotoxina por debajo de 0.1 EU/mL, después de tratada con polimixina B. Posteriormente, se evaluó el efecto de rAl-CPI sobre células dendríticas derivadas de monocitos (CDmo) y monocitos a nivel de marcadores de superficie y producción de citoquinas; y segundo los efectos de esta molécula en la respuesta de los linfocitos T CD4+ ante B. tropicalis y un estímulo policlonal (antiCD2/3/28). Para esto, se realizó un estudio experimental, en el cual se extrajeron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) provenientes de controles no alérgicos, no parasitados y de pacientes alérgicos a B. tropicalis, siguiendo estándares éticos. Los resultados muestran que rAl-CPI puede inhibir la maduración inducida por LPS de las CDmo y los monocitos, además, de disminuir la producción de citoquinas inflamatorias. Estos efectos variaron de acuerdo con la dosis utilizada de rAl-CPI en CDmo, mientras que a la dosis de 1 µM hubo una reducción significativa de los marcadores HLA-DR, PD-L1 y CD86, fue a la dosis de 0.1 µM donde se pudo obtener resultados significativos en la reducción de citoquinas inflamatorias (IL-6, IL-8 y TNF). En monocitos, la reducción en la expresión de los marcadores HLA-DR y PD-L1 y los niveles de las citoquinas IL-1β e IL-10 inducida por LPS se observó a la dosis de 1 µM de rAl-CPI. Los efectos inmunomoduladores de rAl-CPI también se pudieron apreciar en la respuesta de los linfocitos T CD4+. En cultivos de PBMC provenientes de pacientes y controles, rAl-CPI inhibió la proliferación de los linfocitos T CD3+CD4+ estimulados con anti-CD2/3/28 acompañado de una disminución en la producción de IL-5 y un aumento de IFN-γ, sin cambios en los niveles de IL-10. Este resultado fue independiente del efecto que tiene rAl-CPI en monocitos y células dendríticas, dado que un efecto similar se observó en linfocitos T CD3+CD4+ purificados. Asimismo, rAl-CPI disminuyó significativamente la producción de IL-5 e IL-10 inducida por B. tropicalis en PBMC de pacientes alérgicos. En conclusión, rAl-CPI tiene efectos inmunomoduladores en células dendríticas derivadas de monocitos, en monocitos de sangre periférica y en la respuesta inmune de linfocitos T CD4+ hacia B. tropicalis y estímulos policlonales que podrían reducir la intensidad de la respuesta inflamatoria de tipo alérgico, posiblemente por mecanismos independientes de la IL-10.

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Respuesta inmune de anticuerpo IgE contra AGE-BSA en pacientes con rinitis alérgica

Merlano Barón, Andrés Ernesto | 2019

Las enfermedades alérgicas son en la actualidad un grupo de enfermedades inflamatorias altamente prevalentes. Afectan a casi un cuarto de la población mundial y generan altos costos a los servicios de salud. En nuestro país diversos estudios muestran una tendencia similar. Una de las hipótesis que trata de explicar este fenómeno es la de la dieta. El cambio de patrones dietarios, ancestrales y rurales, caracterizados por mayor consumo de frutas y vegetales, así como un estilo de vida rodeado de mayor biodiversidad y microbios a uno más occidental, sedentario y con consumo de azucares y pocas frutas y vegetales, ha sido responsabilizado en generar un estado proinflamatorio inductor de una respuesta alérgica. Una de las moléculas mejor estudiadas y presentes en gran cantidad en alimentos propios de la dieta occidental como papas fritas, hamburguesas, etc. son los AGEs (Productos finales de glicación avanzada), estos se generan por la cocción de los alimentos a altas temperaturas y poca humedad, actúan sobre receptores (RAGEs) presentes en las células del sistema inmune e inducen señales de activación. De otra parte, también actúan como antígenos al inducir una respuesta de anticuerpos. En el presente proyecto pretendemos establecer si la respuesta inmune de IgE podría tener algún papel en enfermedades tales como la rinitis alérgica. Para este estudio, utilizaremos muestras de pacientes ya clasificados en la seroteca del instituto; la reactividad hacia los AGEs se determinará por ELISA y el antígeno se obtendrá mediante la glicación de la albumina bovina sérica (BSA). Los datos se analizarán por diversos métodos estadísticos. Con los resultados obtenidos esperamos contribuir al conocimiento de las posibles causas de las enfermedades alérgicas, así como buscar mecanismos de ayudar a mejorar la calidad de vida de los pacientes que la padecen.

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Repositorio Institucional

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Allergenic activity of Glutathione Transferase derived from Blomia tropicalis (Blo t 8) masterThesis

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Allergenic activity of Glutathione Transferase derived from Blomia tropicalis (Blo t 8) ﻿ masterThesis

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