NANOTRANSPORTADORES DE POLIFENOLES: APLICACIÓN EN LA INDUSTRIA COSMÉTICA KATHERIN SOFIA LOPEZ MIRANDA UNIVERSIDAD DE CARTAGENA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS PROGRAMA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA CARTAGENA DE INDIAS 2023. NANOTRANSPORTADORES DE POLIFENOLES: APLICACIÓN EN LA INDUSTRIA COSMÉTICA KATHERIN SOFIA LOPEZ MIRANDA Trabajo de grado presentado como requisito para optar por el título de Químico Farmacéutico CLAUDIA MILENA BAENA ARISTIZABAL Q. F., PhD. Directora del trabajo UNIVERSIDAD DE CARTAGENA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS PROGRAMA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA CARTAGENA DE INDIAS 2023. Nota de Aprobación del jurado ________________________ ________________________ ________________________ Presidente del jurado ________________________ _________________ Jurado ____________________ Jurado CARTAGENA DE INDIAS, 2023 La universidad de Cartagena ni el jurado examinador, se hacen responsables de los conceptos emitidos en el presente trabajo CARTAGENA DE INDIAS, 2023 AGRADECIMIENTOS En primer lugar, agradezco a Dios por darme la vida, salud y la fortaleza para llegar hasta este punto y permitirme culminar esta gran etapa de mi vida. Agradezco a mi madre Ruth Marina Miranda Lara, a mi abuela Cecilia Lara Salgedo, a Manuel Vásquez González, a mi hermano Zhair David, a mi prima y amiga Valentina, a mi primo Elias, a mi tía Norma Isabel Miranda, a mis tíos Luis Carlos Miranda, Rafael Mendoza Goez, Jorge Miranda y a mi tío paterno José Lopez, por ser un apoyo incondicional siempre durante todo este proceso. Agradezco mi Alma Mater, la Universidad de Cartagena y a la Facultad de Ciencias Farmacéuticas por permitirme cumplir esta gran meta de ser Química Farmacéutica. A mis amigos y compañeros de la facultad por estar presente en los momentos de estudio y brindarme su apoyo en este proceso Richard Giraldo, Pedro Andrade, Maryory Cánchala, Cesar Carrillo, Karen Tulcán, Natalia Chacón, Robert Ibáñez, Ana María Mazo, Jessica Matute, David Ortega, Jorge Guzmán y José David Tardecilla. Igualmente, quiero darles las gracias a todos mis profesores, por transmitirme todo su conocimiento en mi proceso de formación, por ser más que docentes y brindarme su amistad, a la hoy decana la Dra. Maria Osorio Fortich, a la profesora Olga Cuadrado, a la profesora Shirley Cavadia, al profesor Fredy Diaz, a la profesora Deniles De Arco, al profesor Santiago Lora y a los profesores Juan Urrego, Carlos Bernal y Harold Gómez. A la secretaria Iveth por ser una gran amiga brindarme sus concejos. Igualmente extiendo mi agradecimiento a todo el cuerpo docente y administrativos y al grupo de investigación de Tecnología Farmacéutica, Cosmética y de Alimentos (GITFCA). Finalmente, infinitas gracias a mi tutora y profesora Claudia Baena Aristizábal, por ser una guía y una amiga para mí, por brindarme su conocimiento, su tiempo y sus muchos consejos. Son insuficientes las palabras para expresar toda la gratitud para cada una las personas que ayudaron durante este proceso, infinitas gracias y bendiciones. TABLA DE CONTENIDO Página RESUMEN ............................................................................................................. 1 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 3 2. POLIFENOLES................................................................................................ 5 2.1 Clasificación .............................................................................................. 6 2.2 Polifenoles usados en cosmética .............................................................. 7 2.2.1 Resveratrol ........................................................................................... 11 2.2.2 Galato de epigalocatequina (GEGC)..................................................... 12 2.2.3 Quercetina ............................................................................................ 12 2.2.4 Curcumina ............................................................................................ 13 2.3 Aplicaciones ................................................................................................ 14 3. SISTEMAS NANOTRANSPORTADORES DE INGREDIENTES FUNCIONALES COSMÉTICOS ........................................................................... 16 3.1 Clasificación ................................................................................................ 16 3.2 Nanotransportadores Poliméricos ............................................................... 18 3.2.1 Nanocápsulas ....................................................................................... 18 3.2.2 Nanoesfera ........................................................................................... 19 3.3 Nanotransportadores lipídicos..................................................................... 20 3.3.1 Liposomas ............................................................................................ 20 3.3.2 Niosomas.............................................................................................. 21 3.3.3 Nanopartículas solidas lipídicas ............................................................ 22 3.3.4 Nanoemulsiones ................................................................................... 23 4 MATERIALES DE RECUBRIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE NANOPARTÍCULAS ............................................................................................ 25 4.1 Ácido poliláctico (PLA) ................................................................................ 28 4.2 Ácido poliláctico-co-glicólico PLGA ............................................................. 29 4.3 Alginato ....................................................................................................... 29 4.4 Quitosano ................................................................................................... 30 5 TÉCNICAS UTILIZADAS PARA LA NANOENCAPSULACIÓN ...................... 31 5.1 Fluido supercrítico ....................................................................................... 31 5.1.1 Rápida expansión de las soluciones supercríticas (RESS) ................... 32 5.1.2 Gas anti-solvente (GAS) ....................................................................... 34 5.2 Nanoprecipitación ....................................................................................... 35 5.3 Emulsificación ............................................................................................. 36 5.3.1 Emulsificación espontánea ................................................................... 37 5.3.2 Método de temperatura de inversión de fase ........................................ 38 5.3.2.1 Método de Composición de inversión de fase .................................... 40 5.4 Emulsificación de evaporación de solvente ................................................. 40 6. COMPARACIONES DE TAMAÑO DE PARTÍCULAS, EFICIENCIA DE ENCAPSULACIÓN Y PRUEBAS DE EFICACIA. ................................................. 42 6.1 Tamaño de partícula ................................................................................... 46 6.2 Eficiencia de encapsulación ........................................................................ 49 6.3 Pruebas de eficacia ........................................................................................ 52 6.3.1 Actividad antienvejecimiento ....................................................................... 53 6.3.2 Actividad antioxidante ................................................................................. 54 6.3.3 Actividad fotoprotectora ............................................................................... 55 7. CONCLUSIONES ............................................................................................ 60 8. RECOMENDACIONES .................................................................................... 62 9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 63 INDICE DE TABLAS Tabla 1. Grupos polifenólicos con sus diversos exponentes, principales fuentes y estructuras. ............................................................................................................ 8 Tabla 2. Materiales y métodos empleados en la nanoencapsulación de polifenoles. ............................................................................................................................. 27 Tabla 3. Efecto de distintos factores sobre el tamaño de partícula y la eficiencia de encapsulación (EE%) de nanoencapsulados polifenólicos. .................................. 43 Tabla 4. Pruebas de eficacia realizadas a diferentes compuestos fenólicos nanoencapsulados en la industria cosmética. ...................................................... 58 INDICE DE FIGURAS Figura 1. Estructura base de los polifenoles. ......................................................... 5 Figura 2. Esquema de clasificación de los compuestos polifenólicos. ................... 6 Figura 3. Estructura química del trans-resveratrol. .............................................. 11 Figura 4. Estructura química galato de epigalocatequina (EGCG)....................... 12 Figura 5. Estructura química de la quercetina. .................................................... 13 Figura 6. Estructura química de la Curcumina. .................................................... 14 Figura 7. Clasificación de los sistemas nanotransportadores de ingredientes funcionales cosméticos. ....................................................................................... 17 Figura 8. Representación gráfica de una nanocápsula mononuclear. ................. 18 Figura 9. Representación gráfica de una nanoesfera. ......................................... 19 Figura 10. Representación gráfica de un liposoma. ............................................. 20 Figura 11.Representación gráfica de un niosomas. ............................................. 22 Figura 12. Representación gráfica de una nanopartícula lipídica sólida. ............. 23 Figura 13. Representación gráfica de sistemas de nanoemulsión. ...................... 24 Figura 14. Representación esquemática del proceso RESS. .............................. 33 Figura 15. Representación esquemática del proceso GAS.................................. 35 Figura 16. Representación esquemática de la técnica de nanoprecipitación. ...... 36 Figura 17. Representación esquemática de la técnica de emulsificación espontanea. ......................................................................................................... 38 Figura 18. Representación esquemática del método temperatura de inversión de fase. ..................................................................................................................... 39 Figura 19. Representación esquemática del método composición de inversión de fase. ..................................................................................................................... 40 Figura 20. Representación esquemática del método Emulsificación - Evaporación de solvente. ......................................................................................................... 41 Figura 21. Gráfico tamaño de partícula para cada sistema de Nanoencapsulación. ............................................................................................................................. 47 Figura 22. Gráfico porcentaje de Eficiencia de Encapsulación (EE%) para cada técnica de nanoencapsulación de polifenoles en cosmética................................. 50 LISTA DE ABREVIATURAS CO2SC: CO2 supercrítico. CP: Compuestos polifenólicos. CF: Compuestos fenólicos. EE%: Porcentaje de eficiencia de encapsulación. EGCG: Galato de epigalocatequina. GAS: Gas anti-solvente. LPs: Liposomas. MPa: Megapascal min: Minutos NES: Nanoemulsiones. ND: No disponible. nm: Nanómetro. NS: Niosomas. NSL: Nanopartículas sólidas lipídicas. PLA: Ácido poliláctico. O/W: Aceite en agua. PLGA: Ácido poliláctico-co-glicólico. RESS: Rápida expansión de las soluciones supercríticas. RH40: Aceite de ricino hidrogenado rpm: Revoluciones por minuto ROS: Radicales libres. SPF: Factor de fotoprotección solar. TPGS: Succinato de polietilenglicol de tocoferilo T-80: Tween 80 T-20: Tween 20 UV: Radiación ultravioleta. UV-A PF: Factor de protección UV-A. W/O: Agua en aceite. HLB: Balance hidrofílico lipofílico RESUMEN Los polifenoles son un grupo de moléculas químicas que presentan unidades de fenol en su estructura molecular, hacen parte de los compuestos bioactivos antioxidantes más interesantes presentes en las plantas y muestran un amplio uso en la industria de alimentos, farmacéutica y cosmética. Considerando que una gran variedad de productos cosméticos tiene limitaciones de entrega para la administración cutánea, la nanotecnología se convierte en una solución. Por ende, la nanoencapsulación se ha convertido en una estrategia para nuevos productos mejorando la formulación y la entrega de ingredientes funcionales. Las ventajas que esta proporciona, son, mejora de la estabilidad de los ingredientes encapsulados, aumento de la biodisponibilidad, permitir una liberación controlada, mantener la barrera cutánea y aumentar la eficacia de ingredientes funcionales. El objetivo de la presente revisión es presentar una visión general de los diferentes métodos de nanoencapsulación de polifenoles, las técnicas y materiales frecuentemente utilizados en la encapsulación. Así como, realizar comparaciones del tamaño, eficiencia de encapsulación (EE%) y las pruebas de eficacia en diferentes estudios. Los resultados de la presente monografía muestran que las técnicas de nanoencapsulación más empleadas para los polifenoles en productos cosméticos, son: La técnica de fluido supercrítico, nanoprecipitación, emulsificación espontánea y la emulsificación por evaporación de solvente entre otras. Por otro lado, los materiales de recubrimiento principalmente empleados son biopolímeros, tales como: Ácido poliláctico (PLA), Poliácido-láctico-co-glicólico (PLGA), alginato y quitosano. Los principales factores que afectan el tamaño de las nanopartículas y la EE% son: Los biopolímeros utilizados, la temperatura, la velocidad y tiempo de agitación, la presión en el caso de las técnicas de fluido supercrítico entre otros. Finalmente, para la evaluación de la eficacia de cada una de las actividades presentadas por los polifenoles nanoencapsulados, se encuentran: Las pruebas de inhibición de la enzima colagenasa y elastasa, para la evaluación de la actividad antienvejecimiento. Así como pruebas para la actividad antioxidante, como: El método de DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo), y la prueba de capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC). Finalmente, entre las pruebas 1 empleadas en la actividad fotoprotectora se encuentran, la prueba de factor de protección Solar (SPF) y la evaluación del factor de protección UV-A (UV-A PF). Palabras clave: Polifenoles, nanoencapsulación, Cosméticos, tamaño de partícula, eficiencia de encapsulación, prueba eficacia. 2 1. INTRODUCCIÓN Los polifenoles son metabolitos secundarios que se encuentran en las plantas vasculares, estos tienen un papel importante en la defensa contra patógenos vegetales, así como a la agresión de animales herbívoros y también a condiciones de diversos factores ambientales, como son la lluvia y la radiación solar. Cuentan con estructuras que van desde moléculas simples hasta complejas, conformadas por ciclos bencénicos que llevan uno o varios grupos funcionales hidroxilo (Conte et al., 2016; Daglia, 2012 ). Dependiendo del número de anillos fenólicos que tienen y de sus sustituyentes, los polifenoles pueden agruparse en ácidos fenólicos, estilbenos, lignanos, alcoholes fenólicos y flavonoides (Quiñones & Aleixandre, 2012). Los polifenoles tienen una alta actividad antioxidante, lo que los convierten en ingredientes deseables para la industria farmacéutica y cosmética llegando a usarse en productos para el cuidado de la piel conocidos como cosmecéuticos que se han desarrollado a base de extractos polifenólicos. Estos inhiben la actividad de las proteinasas, que catalizan la degradación de las proteínas de la piel, como el colágeno y la elastina dando firmeza y elasticidad. La aplicación tópica de sustancias activas antioxidantes puede apoyar el propio sistema antioxidante de la piel contra el estrés oxidativo y podría proteger la piel contra el fotoenvejecimiento a largo plazo (Zillich et al., 2015). Los compuestos fenólicos presentan problemas de estabilidad y eficacia que afectan su uso en cosmética, debido a su importante sensibilidad a los factores ambientales, incluidas las condiciones físicas, químicas y biológicas. Desafortunadamente, en su forma libre, pueden mostrar una solubilidad limitada en agua y se oxidan muy rápidamente, lo que lleva a la aparición progresiva de un color marrón, olores no deseados y una pérdida considerable de su actividad. Por lo tanto, la administración de compuestos fenólicos requiere la formulación de un producto protector terminado capaz de mantener la integridad estructural del polifenol hasta su administración o consumo, aumentando así su solubilidad en agua y biodisponibilidad. Entre los métodos de estabilización existentes, la encapsulación 3 es un medio interesante (Munin & Edwards-Lévy, 2011; Scalbert et al., 2005), razón por la que se han desarrollado sistemas de nano entrega capaces de mantener la integridad estructural de las moléculas bioactivas. Los sistemas nanotransportadores utilizados principalmente en cosmética se pueden clasificar en sistemas de nanotransporte poliméricos: Entre los cuales se encuentran las nanocápsulas, las nanoesferas, los dendrímeros y las nanofibras. En segundo lugar, se encuentran los sistemas lipídicos: De los cuales destacan los liposomas, las nanopartículas lipídicas sólidas y las nanoemulsiones, siendo estas las más utilizadas en esta industria cosmética (Munin & Edwards-Lévy, 2011). Entre las ventajas que tienen estos sistemas se encuentran el aporte de una mayor área de superficie, mayor solubilidad, estabilidad mejorada, liberación controlada, menor irritación de la piel y protección contra la degradación. Además, los sistemas nanoencapsulados pueden tener diversas formas, como esféricos o compactos, tubulares, complejos no esféricos, agregados o aglomerados homogéneos, micelas y liposomas (Fang & Bhandari, 2010; Vinardell & Mitjans, 2015). En esta monografía se realizó la clasificación de los distintos tipos de sistemas nanoencapsulados. Así mismo se llevó a cabo la recopilación de información acerca de los materiales de recubrimiento y técnicas comúnmente utilizadas. Por último, se realizaron comparaciones de tamaño de partícula, eficiencia de encapsulación (EE%) y pruebas de eficacia en diferentes investigaciones. Con la presente revisión se buscó ampliar la información sobre los diferentes tipos de nanotransportadores de compuestos fenólicos utilizados en diversas formulaciones cosméticas, con el objetivo de dar a conocer los nanotransportadores como una alternativa favorable en la entrega de polifenoles en formulaciones cosméticas. 4 2. POLIFENOLES Los compuestos polifenólicos (CP) son metabolitos secundarios distribuidos en todas las plantas superiores, dotándolas de color y propiedades organolépticas. Estos compuestos tienen una amplia variedad de estructuras fenólicas siendo aproximadamente más de 8000. También forman parte del grupo de sustancias más abundantes en el reino vegetal (Conte et al., 2016; Daglia, 2012). A su vez, aportan diferentes efectos relevantes a nivel biológico, como acciones antialérgicas, antimicrobianas y antiinflamatorias (Esfanjani & Jafari, 2017; Khan et al., 2019). Se ha asociado la actividad antioxidante y la eficiencia de los CP con su estructura química, debido a los núcleos fenólicos que actúan como un eficaz detector de especies reactivas (De Lima et al., 2020). Una característica de los polifenoles es la presencia de anillos de benceno reemplazados por grupos hidroxilo, como se muestra en la Figura 1. Estos se pueden clasificar según el número de anillos fenólicos y los sustituyentes que presentan, en los siguientes grupos: Ácidos fenólicos derivados del ácido hidroxibenzoico o del ácido hidroxicinámico, estilbenos, lignanos, alcoholes fenólicos y flavonoides (Guardado et al., 2012; Quiñones & Aleixandre, 2012). Figura 1. Estructura base de los polifenoles. Adaptado de: Conte et al. (2016). 5 2.1 Clasificación Los CP pueden clasificarse de acuerdo con las variaciones en su estructura química, como, grado de oxidación, metilación, hidroxilación, glicosilación y conexiones posibles con diversas moléculas (Rambaran, 2020). Para clasificar los polifenoles de manera general y simple se puedes dividir en cuatro clases: Flavonoides, cumarinas, estilbenos y taninos. Los flavonoides a su vez se subdividen en seis subclases, antocianidinas, catequinas, flavonas, flavonoles, flavanonas e isoflavonas (Figura 2) (Conte et al., 2016). Los polifenoles presentan en su estructura como característica común un grupo hidroxilo fenólico que limita con más de un anillo de benceno hidroxisutituido. De acuerdo con la cantidad presente de anillos fenólicos y los demás elementos que conforman su estructura, estos compuestos pueden ser clasificados en diferentes grupos (Khan et al., 2019). Figura 2. Esquema de clasificación de los compuestos polifenólicos. Antocianinas Catequinas Flavonas Flavonoides Flavonoles Cumarinas Polifenoles Flavanonas Estilbenos Isoflavonas Taninos Imagen propia. 6 2.2 Polifenoles usados en cosmética Los polifenoles se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, en numerosas especies vegetales (en sus órganos vegetativos y generativos), donde desempeñan un papel relacionado con la supervivencia de la planta (Adamska & Zgórka, 2019; De Lima et al., 2020). Estos compuestos se caracterizan por presentar unidades de fenol en su estructura molecular. Por lo tanto, su uso en productos cosméticos se ha vuelto popular, como el caso de la curcumina presente en los rizomas de la Cúrcuma longa, convirtiéndose en un poderoso eliminador de radicales libres (Arct & Pytkowska, 2008; Stevanato et al., 2014). Actualmente se implementan con frecuencia en formulaciones cosmética, CP como el caso del resveratrol, el galato de epigalocatequina (EGCG) y la quercetina, gracias a las propiedades que aportan a los productos y dándoles así un interés comercial, tales como propiedades antienvejecimiento y de fotoprotección solar. La Tabla 1, plasma los diversos grupos polifenólicos utilizados y encapsulados en productos cosméticos con sus respectivas estructuras químicas y sus fuentes principales. Entre los CP usados comúnmente en el área cosmética gracias a sus propiedades antioxidantes, las cuales le brindan la capacidad de aplicarse en productos con propiedades anti-edad o antienvejecimiento y de protección solar, se encuentran el resveratrol, la quercetina, el EGCG y la curcumina. 7 Tabla 1. Grupos polifenólicos con sus diversos exponentes, principales fuentes y estructuras. Grupos Ejemplos Fuentes Estructura química Referencias polifenólicos Cianidina, Vino tinto, berenjenas, (Gonzalez et al., 2018) Pelargonidina, coles, habichuelas, (Wallace & Giusti, 2015) Antocianinas Delfinidina, cebollas, rábanos, fruta en (Fang & Bhandari, 2010) Petunidina. general. (Conte et al., 2016) Albaricoque, cereza, uva, (Fang & Bhandari, 2010) Catequina, melocotón, manzana, té (Tsanova-Savova et al., Catequinas Epicatequina. 2005) verde y negro, vino tinto. (Conte et al., 2016) Aspigenina, Luteolina, Perejil, apio, trigo, cáscaras (Conte et al., 2016) Flavonas Tangeretina, de cítricos. (Fang & Bhandari, 2010) Nobiletina. 8 Grupos Ejemplos Fuentes Estructura química Referencias polifenólicos Miricetina, Cebollas, brócoli, Flavonoles Quercetina, (Conte et al., 2016) arándanos, vino tinto, té. (Fang & Bhandari, 2010) Kaempferol. Hesperetina, Pomelo, naranja, limón, (Conte et al., 2016) Flavanonas Naringenina, tomate, menta. (Fang & Bhandari, 2010) Eriodictiol. Genisteína, (Conte et al., 2016) Isoflavonas Daidzeína, Plantas leguminosas, soja. (Fang & Bhandari, 2010) Gliciteína. (Cassidy-Aedin et al., 2000) 9 Grupos Ejemplos Fuentes Estructura química Referencias polifenólicos Frijol Tonka, castaño, trébol Ombeliferona, oloroso (Melilotus (Conte et al., 2016) Cumarina Esculetina, officinalis), Hierba de los (Flick, 1997) Escopoletina. ángeles (Angelica (Cao et al., 2019) officinalis). Vino, piel de las uvas, las (Conte et al., 2016) Estilbenos Resveratrol. (Shen et al., 2009) nueces y las bayas (Cassidy-Aedin et al., 2000) Elagitaninos, Ácido Taninos elágico y Granada (Conte et al., 2016) (Fang & Bhandari, 2010) Florotaninos. 10 2.2.1 Resveratrol Se considera un importante antioxidante, que se encuentra abundantemente en el vino tinto, las uvas, las moras, las nueces y en las bayas (Nichols & Katiyar, 2010). Este estilbeno en su forma de trans-resveratrol presenta varios efectos biológicos, como el efecto antienvejecimiento, antioxidantes y protección contra la radiación UV, su estructura se muestra en la Figura 3 (Oliveira & Dors, 2007). Algunos estudios recientes afirman que el resveratrol podría ser un ingrediente cosmético eficaz para la protección de la piel, debido a su capacidad fotoprotectora. Al mismo tiempo, se ha demostrado su uso potencial para el tratamiento de diferentes afecciones relacionadas con los radicales libres (ROS) y el estrés oxidativo, que conducen al envejecimiento de la piel. Además, hay evidencia de un mayor uso de este antioxidante, como componente de las cremas antiarrugas (Adamska & Zgórka, 2019; Caddeo et al., 2013). El resveratrol también tiene la cualidad de reducir el acné, esto principalmente debido a las propiedades antibacterianas contra Propionibacterium acnes y al tiempo que reduce la producción de sebo, por lo que permite su uso como ingrediente funcional en cosmecéuticos (RatzŁyko & Arct, 2019). Figura 3. Estructura química del trans-resveratrol. Adaptado de: Afaq & K. Katiyar (2012). 11 2.2.2 Galato de epigalocatequina (GEGC) El Galato de epigalocatequina es la principal catequina activa del té verde Camellia sinensis L. y se ha encontrado principalmente en sus hojas. Este se caracteriza por prevenir el fotoenvejecimiento y proporcionar protección a la piel contra el daño causado por la radiación UV-A encontrada en un rango del espectro de luz de 320nm a los 400 nm y UV-B entre los 290nm a 320 nm, disminuyendo así la respuesta inflamatoria producida por la exposición al sol (Anunciato & Da Rocha, 2012; Tobi et al., 2002). Esto permite que el GEGC se incorpore a las formulaciones convencionales de protección solar, para aumentar la fotoprotección proporcionada por los filtros UV. A continuación en la Figura 4 se puede observar su estructura química (Tobi et al., 2002). Figura 4. Estructura química galato de epigalocatequina (EGCG). Adaptado de: Bianchi et al (2011). 2.2.3 Quercetina Las características estructurales de la quercetina le confieren una potente actividad antioxidante debido a sus propiedades para la eliminación de radicales libres. En la Figura 5 se muestra su estructura. Encontrándose en diversas fuentes de alimentos como cebollas, puerros, brócoli, arándanos y col rizada. La quercetina es uno de los flavonoles que mayor efecto fotoprotector UV-A ha mostrado, por lo que tiene mayor 12 participación en formulaciones cosméticas, especialmente en protectores solares, ya que cumple con lo necesario para aportar las características que suelen formar parte de este tipo de productos como el factor de fotoprotección solar (SPF) y la relación UV-A/UV -B existente. Esto se puede lograr con la ayuda de formulaciones en las que la quercetina se pueda usar en combinación con apigenina, kaempferol o, en su defecto, con ácido cafeico, asegurando una mayor protección solar (Stevanato et al., 2014). La quercetina también tiene propiedades antioxidantes y antiinflamatorias. Sin embargo, tiene una baja absorción en la piel, por lo que la nanoencapsulación de este compuesto permite un uso óptimo de este en el campo cosmético (Dal Belo et al., 2009). Figura 5. Estructura química de la quercetina. Adaptado de: Singh et al (2021). 2.2.4 Curcumina La Curcumina es un polifenol hidrófobo derivado del rizoma de hierbas perennes pertenecientes a la familia del jengibre. Se considera una sustancia segura y tiene una aplicación notable como aditivo cosmético, así como en productos farmacéuticos y alimenticios (Jiang et al., 2021; Kavita Rohilla et al., 2021). Tiene aplicaciones que van desde colorantes alimentarios y aditivos hasta actividades terapéuticas, como antiinflamatorias, antimicrobianas y anticancerígenas. También presenta aplicación cosmética relacionada con su capacidad antioxidante. Sin embargo, la curcumina tiende a presentar limitaciones de aplicación debido a su 13 baja solubilidad, por lo que muchos estudios se han centrado en mejorar la funcionalidad de este polifenol y así superar esta limitación, esto a través de la nanoencapsulación. Su estructura química se puede observar en la Figura 6 (Rafiee et al., 2019). Figura 6. Estructura química de la Curcumina. Adaptado de: Kavita Rohilla et al (2021). 2.3 Aplicaciones Los compuestos fenólicos CF han generado una atención considerable como componentes activos en formulaciones cosméticas, por lo que actualmente se desarrolla una gran variedad de productos cosméticos especializados en el cuidado de la piel, basados en extracto de plantas enriquecidos con polifenoles (Zillich et al., 2015). Los CF tienen principalmente una acción antioxidante, lo que permite la reducción del daño oxidativo. Estos compuestos también contribuyen en la reducción del deterioro oxidativo de los componentes funcionales y previniendo la oxidación de los componentes grasos en las formulaciones cosméticas. Igualmente presentan una acción fotoprotectora lo que permite su uso en tratamientos de pieles estresadas por el sol, mediante una actividad antiinflamatoria (Arct & Pytkowska, 2008; Khan et al., 2019). ➢ Actividad antienvejecimiento Recientemente, los extractos polifenólicos se han posicionado como uno de los componentes más efectivos en cosméticos antienvejecimiento (Moreira et al., 2017). Estos proporcionan una actividad anti-colagenasa y anti-elastasa debida 14 especialmente a la quercetina y el ácido gálico, presentes en fuentes vegetales mencionadas en la Tabla 1. Otros estudios han demostrado una actividad inhibitoria de la elastasa, una enzima que degrada la elastina y la enzima hialuronidasa que cataliza la degradación del ácido hialurónico en la matriz extracelular (Azcona, 2006; De Lima et al., 2020). ➢ Fotoprotección solar Una aplicación relevante atribuida a estos CF es la actividad de protección solar, ya que absorben la radiación UV, gracias a la presencia de cromóforos en su estructura impidiendo que la radiación penetre en la piel (Gomes et al., 2021). Algunos derivados fenólicos, como los estilbenos, flavonoides y ácidos hidroxicinámicos, han exhibido una considerable absorción de radiación UV, con un factor de protección solar de 7 a 29. Este valor de SPF se encuentra entre los valores mínimos de referencia de SPF (2 a 12) a valores moderados (12 a 30). Los estudios han destacado a la planta Camellia sinensis o comúnmente conocida como té verde, como una fuente abundante de polifenoles, tales como: Las catequinas, el ácido fenólico y EGCG, con una capacidad fotoprotectora demostrada por la prueba de eficacia en el retraso del eritema cutáneo tras la radiación UV-B, disminuyendo los niveles de peróxido de hidrógeno (H2 O 2) en la epidermis (Potapovich et al., 2013; Stevanato et al., 2014). ➢ Excipientes cosméticos Los polifenoles se han estado empleando como excipientes en las formulaciones cosméticas, ya sea como antioxidantes para prevenir o bien reducir el deterioro oxidativo de los componentes funcionales del cosmético o para prevenir la oxidación del contenido de grasa presente en la formulación (Chorilli et al., 2007). También se han empleado los polifenoles con actividad antimicrobiana para contrarrestar el deterioro causado por microorganismos, manteniendo así una inocuidad microbiológica del producto cosmético durante sus procesos de fabricación, envasado y almacenamiento (Herman, 2019). El empleo de compuestos fenólicos permite aumentar la vida útil de la formulación, garantizando así la seguridad del consumidor frente a posibles riesgos para la salud (Victoria et al., 2012). Asimismo, 15 las sustancias fenólicas presentan una actividad antibacteriana que se relaciona con su capacidad para dañar la membrana citoplasmática, así como para inhibir la síntesis de ácidos nucleicos y restringir el metabolismo energético de los microorganismos (Cushnie & Lamb, 2011). 3. SISTEMAS NANOTRANSPORTADORES DE INGREDIENTES FUNCIONALES COSMÉTICOS Las formulaciones cosméticas deben ser química, microbiológica y físicamente estables, así como garantizar la estabilidad y la biodisponibilidad de los componentes activos o funcionales, por lo que se han desarrollado sistemas de nanoentrega capaces de cumplir con estas condiciones (Zillich et al., 2015). Los polifenoles son compuestos de gran aporte en cosmética y realmente convenientes para tratamientos cutáneos, sin embargo, estos tienen una baja solubilidad en agua, lo que dificulta su aplicación y por lo tanto los sistemas de nanoentrega de estos antioxidantes pueden ser una solución adecuada, evitando así este tipo de problemas (Vinardell & Mitjans, 2015). Los sistemas de nanotransportadores se basan en la nanotecnología como la ciencia involucrada en la formación de partículas con diámetros que van desde 1nm hasta los 1000 nm, por lo que el producto final tiene características atribuidas a sus dimensiones, otorgando una mejora en la solubilidad y absorción, minimizando el proceso de degradación, así como reduciendo la toxicidad y controlando la respuesta biológica de los polifenoles (Conte et al., 2016; Santos et al., 2013). 3.1 Clasificación Los sistemas nanotransportadores utilizados principalmente en cosmética se pueden clasificar en sistemas de nanotransporte poliméricos, de los cuales las nanocápsulas, nanoesferas, dendrímeros y nanofibras, son los mayores representantes de este grupo. El siguiente sistema es el lipídico, compuesto por liposomas, nanopartículas lipídicas sólidas y nanoemulsiones, siendo estas las más utilizadas en esta industria cosmética. Finalmente hay transportadores inorgánicos, como nanopartículas metálicas, tales como las de oro o plata, y también se pueden 16 encontrar nanopartículas de sílice. Esto se puede observar en la Figura 7 (Müller et al., 2007; Santos et al., 2019). Figura 7. Clasificación de los sistemas nanotransportadores de ingredientes funcionales cosméticos. Nanocápsulas Nanoesfera Nanotransportadores Poliméricos Dendrímeros Nanofibras Liposomas y sus derivados Nanotransportadores Nanoparticulas lipídicas lipídicos Nanoemulsiones Metálica Nanotransportadores Inorgánicos Sílice Imagen propia. 17 Nanotransportaores 3.2 Nanotransportadores Poliméricos 3.2.1 Nanocápsulas La nanoencapsulación consiste en la tecnología utilizada para empaquetar ingredientes funcionales, ya sea en forma líquida, sólida o gaseosa generalmente en un único núcleo, el cual se encuentra rodeado por un material secundario que recibe el nombre de matriz o pared formando nanocápsulas mononucleares (Figura 8). No obstante, las nanopartículas también pueden contener múltiples núcleos y formar nanocápsulas polinucleares. En la industria cosmética las nanopartículas generalmente presentan un tamaño de partícula entre 10 nm a 100 nm (Vinardell & Mitjans, 2015). Figura 8. Representación gráfica de una nanocápsula mononuclear. Membrana polimérica Polifenol Núcleo interno Imagen propia. Aunque la nanoencapsulación es un proceso comúnmente utilizado para capturar materiales bioactivos a nano escala, también puede encapsular sustancias que no tienen actividad terapéutica. También se ha observado el impacto de la nanoencapsulación de polifenoles como el resveratrol en la penetración en la piel humana, lo que demuestra que las nanocápsulas con pared polimérica, pueden ser un sistema de administración potencial para estos compuestos poco solubles destinados a la aplicación tópica (Friedrich et al., 2015). 18 3.2.2 Nanoesfera Son partículas con una morfología esférica, con un tamaño variable de aproximadamente 10 nm a 200nm. En estas estructuras el componente funcional se encuentra distribuido en la matriz polimérica la cual se dispersa de manera uniforme, de tal manera que se encuentre protegido el componente encapsulado de posibles degradaciones, ya sean de origen químico o enzimático, esto se puede observar en la Figura 9. Este sistema denota un gran potencial, ya que se ha demostrado su capacidad para transportar sustancias que no presentan una buena absorción, poca actividad biológica o son poco solubles, siendo apropiado y útil el uso de este nanosistema (Kaul et al., 2018). Figura 9. Representación gráfica de una nanoesfera. Matriz polimérica Polifenol Imagen propia. Las nanopartículas pueden clasificarse según el tipo de polímero utilizado en su fabricación, en naturales o sintéticas. En el caso de los polímeros de origen natural pueden ser usados la albúmina, el almidón y la gelatina y entre los polímeros sintéticos comúnmente empleados se encuentra el ácido poliláctico (Bilal & Iqbal, 2020; Dubey et al., 2022). La aplicación cosmética de las nanoesferas ha tomado mayor relevancia en el campo cosmético del cuidado de la piel, ya que asegura una correcta entrega en las capas más profundas de estas. Por lo que esta aplicación denota gran favorabilidad 19 en productos destinados a la prevención del deterioro de la piel que presenten rasgos marcados del envejecimiento, como es el caso de las cremas antiarrugas, cremas hidratantes o las cremas antiacné (Guterres et al., 2007). 3.3 Nanotransportadores lipídicos 3.3.1 Liposomas Los liposomas (LPs) se basan principalmente en fosfolípidos naturales o sintéticos, consisten en vesículas esféricas dispuestas en estructuras de bicapa con cabezas polares ubicadas en la superficie de las membranas, en contacto con un medio acuso con las cadenas de ácidos grasos ubicadas en la parte interna, tal como se observa en la Figura 10. Estos sistemas se forman espontáneamente al ser agregados en agua (Vinardell & Mitjans, 2015). Los fosfolípidos comúnmente empleados en estos sistemas son la fosfatidilcolina también llamada lecitina y el colesterol, estos brindan las características de rigidez y capacidad de carga de la bicapa. Los compuestos fenólicos interactúan con los lípidos debido a los enlaces hidrofóbicos, al igual que con los enlaces covalentes y de hidrógeno, lo que conlleva a una disminución de la absorción de lípidos, asimismo los polifenoles pueden capturarse y protegerse. Los LPs permiten un mayor rendimiento en la carga de polifenoles, tales como el caso de la catequina y del GEGC, ya que este tipo de sistema optimiza sus característica antioxidante y a la vez le otorga una liberación controlada con respecto al tiempo (Figueroa et al., 2021). Figura 10. Representación gráfica de un liposoma. Cola hidrofóbica Polifenol Cabeza hidrofílica Imagen propia. 20 Los LPs a una escala nanométrica proporcionan un mayor grado de estabilidad del activo, mejoran la efectividad tópica en la entrega de los ingredientes y muestran una ventaja sobre otras formulaciones convencionales (Montenegro, 2014; I. Santos et al., 2013). También son de utilidad en productos cosméticos, ejemplo de esto son los protectores solares de base acuosa que poseen una mayor afinidad a la superficie de la piel, garantizando que los componentes funcionales permanezcan en el estrato córneo y promoviendo a su vez la hidratación de esta. Además, se pueden encontrar preparados cosméticos como son las cremas y los geles, que pueden contener diversos encapsulados que permiten su aplicación en diversas afecciones de la piel. Estos sistemas se emplean con regularidad en productos con actividad anti edad, acondicionadores para el cabello, en perfumes y protectores solares (Puglia & Bonina, 2012). Los LPs pueden clasificarse según el número de bicapas, de tal manera que pueden presentarse con estructuras esféricas de fosfolípidos multilamelares y se encuentran separadas por diversas capas de agua, estas poseen un tamaño de hasta de 1000 nm. En el caso de las unilamelares cuentan con una única bicapa de fosfolípidos con un centro que contiene la solución acuosa. Los tamaños ideales para los LPs usados para la administración de productos cosmético se establecen entre 50 a 200 nm. Los CF son hidrosolubles, por lo tanto estos estarán encapsulados en el interior del núcleo (Figueroa et al., 2021). 3.3.2 Niosomas Los niosomas (NS) son vesículas conformadas por tensioactivos no iónicos que forma estructuras de bicapa y presentan un núcleo acuso, tal como se aprecia en la Figura 11. Estos se forman por medio de métodos energéticos, como son la agitación física o el calor, estos sistemas permiten transportar fármacos o compuestos funcionales y a su vez obtener una liberación controlada. Los NS presentan algunas ventajas con respecto a los liposomas como lo son una estabilidad química más alta y un menor costo de fabricación (Pando et al., 2013; Vinardell & Mitjans, 2015). 21 Figura 11.Representación gráfica de un niosoma. Tensioactivo Centro acuoso Polifenol Adaptado de: Chen et al (2019). Se ha observado que el resveratrol tiene características fotoprotectoras contra la radiación UV-B, que permite su uso en productos cosméticos fotoprotectores. Pero este compuesto también presenta problemas de estabilidad, debido a que exhibe fotosensibilidad por lo que debe ser protegido de la luz, ya que esta altera el isómerismo de forma irreversible pasando de la molécula activa trans a la cis inactiva. Por ende, los NS se convierten en un sistema conveniente que le proporciona una eficacia de atrapamiento mayor con respecto a otros sistemas nanos (Pando et al., 2013). 3.3.3 Nanopartículas solidas lipídicas Las nanopartículas sólidas lipídicas (NSL) son matrices que se forman a partir de un lípido solidificado, siendo transportadores coloidales nanométricos con altos porcentajes de contenido de agua entre 70 a 95% elaborados de lípidos fisiológicos dispersos en agua o bien en una solución acuosa de surfactante, el tamaño de estas NSL se encuentra entre los 50 nm hasta los 1000 nm, observándose en la Figura 12 (Garzón et al., 2008; Vinardell & Mitjans, 2015). 22 Figura 12. Representación gráfica de una nanopartícula lipídica sólida. surfactante Lípido Poli fenol Imagen propia. Las ventajas de las NSL con respecto a otros sistemas coloidales, se debe a la elevada biocompatibilidad, mayor estabilidad física y la posibilidad de una liberación controlada del componente funcional, facilidad para producción masiva y materias primas económicas. Sin embargo, pueden presentarse limitaciones referentes a la capacidad de carga que está entre el 1% al 30%. Actualmente se presenta un mayor interés en las NSL, esto se evidencia con el aumento de artículos publicados sobre el tema (Chen et al., 2017; Puglia & Bonina, 2012). 3.3.4 Nanoemulsiones Las nanoemulsiones (NEs) son preparados dispersos líquido–líquido donde pequeñas gotas están dispersadas dentro de un líquido inmiscible, la composición de una nanoemulsión consiste en agua, aceite y un surfactante ubicándose en una escala de tamaño nanométrico que oscila entre 20 nm a 200nm, tal como se observa en la Figura 13. La elección de dicho surfactante ayuda a la disminución de la tensión superficial entre la fase acuosa y oleosa, dando como resultado una reducción de tamaño de las gotas y a su vez un aumento de la estabilidad de estas gotas gracias a interacciones electrostáticas repulsivas y al impedimento estérico. Las NEs suelen ser del tipo aceite en agua (O/W) consistiendo en pequeñas gotas 23 de aceite dispersas en un medio acuoso y en el caso de las NEs agua en aceite (W/ O) las gotas de agua se encuentran dispersas en un medio oleoso (McClements & Jafari, 2018; Van et al., 2019). Estos sistemas de NEs tienen diferentes campos de aplicación que incluyen desde la administración de productos farmacéuticos, alimentos y en formulaciones cosméticas, esto se debe a su facilidad de incorporación en formas variadas como cremas, líquidos, geles, aerosoles entre otros. Además de sus características de gran interés como su alta estabilidad cinética, baja viscosidad y su transparencia óptica (Van et al., 2019). La aplicación cosmética de las nanoemulsiones suelen ser las mismas que en el caso de liposomas: proporciona una mejora de su estabilidad y en segundo lugar una mejora de la solubilidad de los elementos poco solubles en agua, como tercero favorece la penetración de la piel y por último el aumento de la actividad antioxidante. Convirtiéndose la nanoemulsión en una alternativa asertiva, gracias al aumento de la superficie proporcionada por el tamaño de sus gotas y siendo posible obtener una mayor cantidad de polifenol incorporado y una solubilidad mejorada (Niknam et al., 2022; Rinaldi et al., 2021). Figura 13. Representación gráfica de sistemas de nanoemulsión. Nanoemulsiones Agua en aceite Aceite en agua w/o o/w 24 Aceite en agua en aceite Agua en aceite en agua o/w/o w/o/w Cabeza hidrofílica Fase acuosa Polifenol lipofílico Molécula de surfactante Po lifenol hidrofílico Fase oleosa Cola hidrofóbica Adaptado de: Santos et al (2022). 4 MATERIALES DE RECUBRIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE NANOPARTÍCULAS La elección correcta del material de encapsulación es esencial de acuerdo con la aplicación prevista, ya que, influye en la eficiencia de encapsulación y la estabilidad de las nanopartículas. Los factores que deben considerarse al seleccionar un material de pared para aplicaciones tópicas incluyen toxicidad, biocompatibilidad, estabilidad, viscosidad, propiedades mecánicas, compatibilidad entre el ingrediente activo y el material de pared, liberación del ingrediente activo del vehículo a la piel, mejora de la penetración activa en el estrato córneo, tamaño de partícula previsto, propiedades microscópicas de la superficie de las nanopartículas y factores 25 económicos y de procesamiento. Dado que la mayoría de los materiales encapsulantes no tienen todas las propiedades requeridas, una práctica común implica una combinación de materiales de pared (Casanova & Santos, 2016). Los materiales encapsulantes se pueden seleccionar entre una amplia variedad de polímeros naturales y sintéticos. Los más utilizados en cosméticos incluyen polisacáridos como son: Quitosano, gomas, celulosas, almidones, ciclodextrinas y proteínas tales como la gelatina, caseína y proteínas de soja, algunos lípidos como ceras, parafina y aceites y polímeros sintéticos como son; polímeros acrílicos, alcohol polivinílico y poli- vinilpirrolidona. Los materiales inorgánicos, como silicatos, arcillas y polifosfatos, también pueden utilizarse como segundos polímeros los biopolímeros o polímeros naturales y los polímeros biodegradables, tales como quitosano y los poliésteres alifáticos, como el ácido poliláctico (PLA) y los copolímeros de ácidos láctico y glicólico, por ejemplo, el ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA), estos últimos son los materiales encapsulantes con mayor interés para aplicaciones en el campo cosmético (Casanova & Santos, 2016; Suganya & Anuradha, 2017). A continuación, en la Tabla 2, Se describen los diversos materiales y técnicas empleadas en la encapsulación de polifenoles en la industria cosmética. Entre las técnicas más empleadas para cada uno de estos nanosistemas de nanoentrega se encuentran; las técnicas de fluido supercrítico, la de nanoprecipitación, emulsificación espontánea, evaporización de solvente y las técnicas de inversión de fase. 26 Tabla 2. Materiales y métodos empleados en la nanoencapsulación de polifenoles. Sistema de Polifenol Material Técnica Referencia nanoencapsulación Emulsificación evaporización-del Curcumina Nanocápsula PLGA (Chereddy et al., 2013) solvente Emulsificación evaporización-del Curcumina Nanoesferas PLA (Tsai et al., 2011) solvente EGCG Liposomas Quitosano/Alginato Fluido supercrítico (Meterc et al., 2008) Nanopartículas sólido- Quercetina PLA Nanoprecipitación (Pandey et al., 2015) lipídicas Resveratrol Nanoemulsiones Quitosano Emulsificación (Wang et al., 2017) Curcumina Liposoma Quitosano Fluido supercrítico (Chen et al., 2022) EGCG Niosomas PLGA Temperatura de Inversión de fase (Rostamabadi et al., 2019) (Davidov & McClements, Resveratrol Nanoemulsión Alginato Emulsificación espontánea 2015) PLA: Ácido poliláctico PLGA: Ácido poliláctico-co-glicólico EGCG: Galato de epigalocatequina. 27 Los materiales encapsulantes con mayor interés para aplicaciones en el campo cosmético son los biopolímeros o polímeros naturales. Estos materiales son de origen natural, no tóxicos, no reactivos al entrar en contacto con los tejidos humanos y pueden descomponerse o metabolizarse y eliminarse del cuerpo a través de vías metabólicas normales, mientras que otros compuestos pueden acumularse potencialmente en los tejidos corporales y causar irritación. Sus propiedades como la tasa de degradación y las propiedades mecánicas están fuertemente definidas por características estructurales, como la composición del copolímero, el peso molecular y la naturaleza de los grupos finales de la cadena. Según la Tabla 2, los polímeros naturales con mayor presencia en los productos en los cuales han nanoencapsulado polifenoles son: El Ácido poliláctico (PLA), el ácido poliláctico-co- glicólico (PLGA), alginato y quitosano (Casanova & Santos, 2016; Suganya & Anuradha, 2017). 4.1 Ácido poliláctico (PLA) El polímero ácido poliláctico (PLA), es un biopolímero termoplástico incoloro, brillante y rígido que se degrada por hidrólisis simple del enlace éster, además este, es un material biocompatible y biodegradable (ver Figura 14). El PLA tiene buenas propiedades físicas, propiedades mecánicas y propiedades no tóxicas. Este biopolímero ha encontrado numerosas aplicaciones, ya que, presenta un amplio rango inusual de propiedades, desde el estado amorfo hasta el estado cristalino (Arpagaus, 2019; Kumari et al., 2010; Serna C. et al., 2011; Zhao et al., 2023). Figura 14. Estructura química de Ácido poliláctico PLA. Adaptado de: Arpagaus (2019). 28 4.2 Ácido poliláctico-co-glicólico PLGA El Ácido poliláctico-co-glicólico o PLGA es un copolímero de PLA y ácido poliglicólico (PGA). Los biopolímeros PLGA están disponibles comercialmente y aprobados por la FDA (Food and Drug Administration) y la EMA (Agencia Europea de Medicamentos) para uso humano, en varios pesos moleculares y proporciones de lactida/glicólido. Dado que el cuerpo se ocupa eficazmente de estos dos monómeros, existe una toxicidad sistémica mínima asociada con el uso de PLGA para la administración o aplicaciones de biomateriales (Kumari et al., 2010). Se pueden obtener diferentes formas de PLGA variando la proporción de lactida a glicólido durante la reacción de polimerización, por ejemplo: PLGA 50:50 se refiere a un copolímero de 50% de ácido láctico y 50% de ácido glicólico. Los polímeros de bajo peso molecular con mayor contenido de glicólido son más hidrófilos y amorfos, por lo tanto, tienen un tiempo de degradación más corto. En la Figura 15 se muestra su estructura química (Arpagaus, 2019; Makadia & Siegel, 2011). Figura 15. Estructura química de ácido poliláctico-co-glicólico PLGA. Adaptado de: Makadia & Siegel (2011). 4.3 Alginato Es un biopolisacárido natural lineal extraído principalmente de dos fuentes diferentes como algas y bacterias. La mayoría de los alginatos comercialmente existentes se producen a partir de algas pardas Macrocystis pyrifera. El alginato derivado de bacterias de Azotobacter y Pseudomonas generalmente no es económica ni comercialmente factible (Wagle et al., 2020). Tiene buena solubilidad en agua, biocompatibilidad y baja toxicidad. Se ha informado que puede mejorar la 29 solubilidad de los ingredientes hidrófobos e inhibir la fotodegradación de los compuestos activos, lo que los hace favorables para aplicaciones en los campos, cosmético, veterinario, farmacéutico y medicinal. A continuación en la Figura 16 se puede observar su estructura química (Ebadollahi et al., 2022; Martins et al., 2017). Figura 16. Estructura química de Alginato. Adaptado de: Wagle et al (2020). 4.4 Quitosano El quitosano se usa ampliamente como material de pared para sistemas de administración de nanopartículas biopoliméricas, debido a sus propiedades catiónicas, biodegradables y no tóxicas. El quitosano es un biopolímero derivado de quitina, compuesto por unidades N-Cetyl-D-glucosamina y unidas por β (1,4) - enlaces glicosídicos, se puede observar su estructura química en la Figura 17. El quitosán es sensible al pH debido a la D-glucosamina en su estructura, de modo que es soluble a pH inferior a 6, sin embargo, es insoluble en pH neutro. Estas propiedades del quitosano lo convierten en un candidato versátil para diversas aplicaciones cosméticas, biomédicas e industriales, incluida la administración de fármacos, la regeneración de tejidos, la cicatrización de heridas, los sistemas de purificación y como componente integral de los suplementos nutricionales. El quitosano es insoluble en agua y solventes orgánicos, siendo solo soluble en soluciones ácidas, lo que frecuentemente limita su aplicación. Sin embargo, es posible modificar la estructura para producir quitosano soluble en agua, que es fácilmente soluble en soluciones acuosas neutras, aumentando el rango de 30 aplicabilidad de este compuesto (Akbari et al., 2020; Casanova & Santos, 2016; Chatterjee et al., 2021). Figura 17. Estructura química de Quitosano. Adaptado de: Akbari et al (2020). 5 TÉCNICAS UTILIZADAS PARA LA NANOENCAPSULACIÓN Las técnicas empleadas para la nanoencapsulación son de mayor complejidad que las utilizadas en la microencapsulación esto se debe principalmente a la dificultad para alcanzar la compleja morfología de los nanoencapsulados, al igual que el material del núcleo que se desea transportar y las demandas de controlar la tasa de liberación. Por lo cual, existen diversos aspectos al momento de escoger la técnica adecuada, entre los que se encuentra el tamaño de partícula deseado, la naturaleza química y física de los materiales del núcleo y de la pared del encapsulado, así como, aspectos económicos y estéticos (Anandharamakrishnan, 2014; Casanova & Santos, 2016). Según la tabla 2, las técnicas de nanoencapsulación mayormente empleadas en el transporte de compuestos polifenólicos en la industria cosmética son: Las técnicas de fluido supercrítico, nanoprecipitación, emulsificación espontánea y la emulsificación por evaporación de solvente. 5.1 Fluido supercrítico Un fluido supercrítico puede comportarse como líquido o gas y es utilizado a temperatura y presión por encima de su punto crítico termodinámico. Estos presentan propiedades intermedias entre líquidos y gases como son un alto poder de solvatación, una baja viscosidad y densidad, así como alta difusividad y altas 31 tasas de trasferencia de masa, las cuales se encuentran por encima de su punto crítico. Algunos compuestos pueden ser llevados a su estado crítico como lo son el dióxido de carbono, el agua, el propano y el nitrógeno (Byrappa et al., 2008). Algunos biocompuestos que suelen ser sensibles térmicamente pueden ser encapsulados por fluidos supercríticos, en la cual se evita la implementación de disolventes de naturaleza orgánica y tóxica, siendo una técnica que puede compararse al secado por pulverización. En esta técnica el compuesto bioactivo o matriz encapsulante al igual que el polímero son solubilizados en un fluido supercrítico, esta solución pasa a través de una boquilla. Posteriormente, el fluido supercrítico será eliminado mediante evaporación durante el proceso de pulverización y finalmente se producen nanopartículas por medio de la precipitación de las partículas de soluto (Ezhilarasi et al., 2013; Montes et al., 2015). Entre las variantes de la tecnología de fluidos supercríticos empleadas en la formación de nanoencapsulados de polifenoles se encuentran las técnicas de rápida expansión de las soluciones supercríticas (RESS) y la metodología de gas anti- solvente (GAS). 5.1.1 Rápida expansión de las soluciones supercríticas (RESS) El método RESS implica tres etapas de operación: (1) disolución del ingrediente activo y el material de recubrimiento en el CO2 supercrítico, (2) producción de la expansión de CO2 a su fase gaseosa, (3) disminución de la solubilidad para la precipitación del material de recubrimiento y el ingrediente bioactivo, formando nanopartículas como se observa en la Figura 18. Este proceso es ampliamente utilizado para generar nanopartículas, en primer lugar, es importante disolver el sustrato sólido en el CO2 supercrítico (CO2SC), para posteriormente actuar como disolvente. Luego, la despresurización de la solución se realiza en una cámara de baja presión, utilizando una boquilla que permite formar pequeñas partículas (Abu, 2021; Lan et al., 2010). La morfología de las partículas varía según la configuración del sustrato, así como, los parámetros del dispositivo dentro de los cuales se encuentra: la distancia, el impacto del chorro, la temperatura y la caída de presión, en el caso del diseño del equipo se tiene en cuenta la geometría de la boquilla. En 32 el proceso, la solución debe liberarse rápidamente en el medio gaseoso para garantizar un tamaño de partícula relativamente pequeño. Esta técnica es particularmente atractiva porque no hay necesidad de utilizar disolventes orgánicos (Reverchon & Adami, 2006). Figura 18. Representación esquemática del proceso RESS. 2. Se produce la expansión, el CO2 vuelve a su fase g aseosa. Válvula de e xpansi ón 3. La disminución de la solubilidad conduce a la precipitación del material de recubrimiento y el ingrediente activo, formando así nanopartículas. 1. El CO2 supercrítico disuelve el ingrediente activo y el Ingrediente activo material de recubrimiento. Material de recubrimiento Nanocápsulas CO2 supercrítico CO2 gaseoso Adaptado de: Abu (2021). 33 5.1.2 Gas anti-solvente (GAS) El Método de gas anti-solvente, GAS se basa en el hecho de que cuando una solución se expande suficientemente por un gas, la fase líquida ya no es un buen disolvente para el soluto y se produce la nucleación. Esta técnica consta de cinco etapas las cuales son: (1) Disolución del activo y el material de recubrimiento en un disolvente orgánico adecuado, (2) pulverización de la solución orgánica en CO2 supercrítico (3) sobresaturación y precipitación de las nanopartículas, (4) recolección de los polvos precipitados, (5) Eliminación del disolvente, como se aprecia en la Figura 19. En el método GAS los componentes de los encapsulados se disuelven en un disolvente orgánico adecuado también llamado primario y luego se introducen en CO2SC, lo que reduce la solubilidad de los componentes en el disolvente orgánico. CO2SC hace esto penetrando rápidamente a través de la solución debido a su alto coeficiente de difusión que afecta un proceso de transferencia de masa que se evidencia por el aumento de volumen, la disminución de la viscosidad y la densidad. La disminución de la densidad reduce significativamente la solubilidad de los componentes en el disolvente, produciendo una solución sobresaturada a partir de la cual los componentes precipitan como micro y nano partículas. Los solutos utilizados en este proceso deben tener una solubilidad mínima en el CO2SC (Abu, 2021; Byrappa et al., 2008; Dias et al., 2022). 34 Figura 19. Representación esquemática del proceso GAS. Adaptado de: Abu (2021). 5.2 Nanoprecipitación La nanoprecipitación o también conocida como técnica de desplazamiento de solvente, es ampliamente utilizada en la fabricación de nanoesferas y nanocápsulas. Tiene mucha similitud con respecto a la técnica de evaporación de solventes. Aquí, la fase solvente que contiene el polímero formador de película y el compuesto bioactivo se encapsulan es un solvente miscible en agua, y la fase oleosa, se mezclan bajo agitación. Posteriormente, el solvente se elimina para producir una suspensión de nanopartículas o nanocápsulas, Este método está ilustrado en la Figura 20 (Abu, 2021). 35 La nano precipitación es la técnica de nanopartículas poliméricas más sencilla que se tenga registro en la actualidad. Su preparación no amerita técnicas de alta homogeneización, ultra centrifugación o tensoactivos. Sin embargo, es necesario resaltar que la utilidad de esta técnica se ve limita a disolventes miscibles en agua, los cuales cuentan con una velocidad de difusión suficiente para generar una emulsificación espontánea. Este método presenta gran eficiencia para encapsular componentes bioactivos de naturaleza lipofílica gracias a la miscibilidad del solvente con la fase acuosa (Almoustafa et al., 2017; Ezhilarasi et al., 2013). Figura 20. Representación esquemática de la técnica de nanoprecipitación. Mezcla de las fases Agitación constante Evaporación del solvente Suspensión acuosa de nanopartículas poliméricas Fase Fase acuosa oleosa Imagen propia. 5.3 Emulsificación La técnica de emulsificación se aplica generalmente para la encapsulación de compuestos bioactivos en soluciones acuosas mediante la producción de nanoemulsiones. Las nanoemulsiones son dispersiones coloidales que comprenden dos líquidos inmiscibles, de los cuales uno se dispersa en el otro, con tamaños de gotas que van de 50 a 1.000 nm. Las nanoemulsiones pueden usarse directamente 36 en estado líquido o secarse en forma de polvo utilizando técnicas de secado como el secado por pulverización y la liofilización después de la emulsificación. Además, las nanoemulsiones poseen una alta estabilidad cinética debido a sus tamaños de gotas de emulsión extremadamente pequeños (Ezhilarasi et al., 2013). Las nanoemulsiones son producidas mediante los métodos de baja energía. Las estrategias de baja energía consisten en la formación de nano gotas de aceite dentro de sistemas mixtos, compuestos por mezclas de agua, aceite y surfactantes, mediados por cambios en la composición de la mezcla o las condiciones ambientales (Espitia et al., 2019; Safaya & Rotliwala, 2020). Los métodos de baja energía son los mayormente empleados para la producción de nanotransportadores polifenólicos como la emulsificación espontánea, la temperatura de inversión de fase (PIT) y la composición de inversión de fase (PIC) (Dini, 2022). 5.3.1 Emulsificación espontánea Una nanoemulsión O/W puede formarse espontáneamente a ciertas temperaturas, dependiendo de la composición química de ambas fases, así como del emulsionante. La emulsificación espontánea, también conocida como autoemulsificación es un método simple y se basa en el movimiento de componentes miscibles en agua como disolvente, surfactante y cosurfactante de una fase orgánica a una fase acuosa. El proceso comienza con la adición de una fase orgánica como el aceite y el surfactante en una fase acuosa y cosurfactante. Esta composición se deja mezclar homogéneamente por agitación magnética, luego se evapora el solvente miscible en agua bajo vacío, obteniendo así la nanoemulsión (Espitia et al., 2019; Kale & Deore, 2017). La rápida migración de componentes miscibles de agua a la fase acuosa, causa una inmensa turbulencia en la interfaz de dos fases que conduce a la formación espontánea de gotas de aceite rodeadas de fase acuosa, como se observa a continuación en la Figura 21 (Jintapattanakit, 2018; Safaya & Rotliwala, 2020). 37 Figura 21. Representación esquemática de la técnica de emulsificación espontánea. Adaptado de: McClements (2011). 5.3.2 Método de temperatura de inversión de fase La nanoemulsificación por temperatura de inversión de fase, se basa en la inversión transicional que puede tener lugar en las emulsiones y que es inducida por cambios en el HLB del sistema que, a su vez, surgen de las fluctuaciones de temperatura. La inversión de la fase de transición sigue el equilibrio entre las afinidades del tensioactivo por la fase acuosa y la de la fase oleosa. Por lo que, a bajas temperaturas, la monocapa de tensioactivos no iónicos, como en el caso de los polisorbatos, es más hidrófila y, por lo tanto, se forman emulsiones O/W. Por el contrario, a temperaturas más altas, estos tensioactivos se vuelven más lipofílicos y por ende se forman emulsiones W/O. A temperaturas intermedias, el HLB se vuelve cero y desciende a valores muy bajos, favoreciendo la formación de emulsiones de pequeño tamaño. El método implica la formación de emulsiones W/O que comprenden una cierta formulación óptima y una fracción particular de volumen de agua a una temperatura por encima del PIT, una temperatura a la que el HLB se convierte en cero, y luego bajando rápidamente a temperatura ambiente. Un 38 contenido suficiente de emulsionantes conlleva a la producción de nanoemulsiones cinéticamente estables (Espitia et al., 2019; Kale & Deore, 2017). El método de temperatura de inversión de fase aprovecha la capacidad específica de los tensioactivos no iónicos para cambiar sus afinidades con el agua y el aceite en función de la temperatura en una composición fija. Las ventajas de este método incluyen su simplicidad y bajo consumo de energía, lo que permite una ampliación industrial del proceso. A su vez, la principal desventaja de esta técnica es que requiere calentamiento durante el proceso de nanoemulsificación lo que puede desencadenar inestabilidad en los componentes termolábiles de la formulación. En la Figura 22, se puede observar una representación esquemática del método PIT para formar nanoemulsiones O/W. Primero se prepara una emulsión W/O mezclando todos los componentes (surfactante, cosurfactante, aceite y agua, etc.) a temperatura ambiente, luego se calienta suavemente el sistema por encima o alrededor de la temperatura de inversión de fase, seguido de un enfriamiento rápido para formar espontáneamente finas gotas de aceite en agua (Saxena et al., 2017). Figura 22. Representación esquemática del método temperatura de inversión de fase. Imagen propria. 39 5.3.2.1 Método de Composición de inversión de fase El método de composición de inversión de fase se basa en un cambio en la fase de la mezcla de emulsión, es decir, w/o a o/w o viceversa, debido a un cambio en la composición de la mezcla de emulsión a una temperatura constante. Implica la adición de los componentes agua o aceite, sobre una mezcla de los otros dos componentes surfactante lipofílico o surfactante hidrofílico, respectivamente. La preparación de nanoemulsiones O/W por el método de composición de inversión de fase se puede dividir ampliamente en 2 pasos: El primer paso es la mezcla de la fase orgánica (aceite + surfactante) para obtener una composición fija y por último la adición de agua, resultando en la formación de nanoemulsiones O/W, como se representa en la Figura 23 (Saxena et al., 2017). Figura 23. Representación esquemática del método composición de inversión de fase. Imagen propia. 5.4 Emulsificación de evaporación de solvente La técnica de emulsificación de evaporación de solvente implica la formación de una emulsión de la solución polimérica en una fase acuosa y la evaporación del disolvente polimérico, induciendo la precipitación del polímero como nanoesferas. El componente activo se dispersa finamente en la red de matriz polimérica. El tamaño de las partículas se puede controlar ajustando la velocidad de agitación, la cantidad y tipo de agente dispersante, la viscosidad de las fases orgánicas y/o acuosas y la temperatura. La homogeneización de alta velocidad debe utilizarse 40 para el desarrollo de nanopartículas de tamaños inferiores a los 250 nm (Hanafi et al., 2013; Mirakabad et al., 2014; Tahir et al., 2021). Para la evaporación de disolventes de doble emulsión, la emulsión de aceite en agua formada se emulsiona de nuevo y homogeneizada antes de la evaporación del disolvente. Las emulsiones dobles del tipo w/o/w se utilizan generalmente para materiales altamente hidrófilos con el fin de mejorar su eficiencia de encapsulación y limitar su difusión fuera de la partícula en la fase continua de emulsiones de aceite en agua. La concentración de surfactante y la tasa de homogeneización son los factores más importantes que afectan el tamaño de partícula. Este método es ventajoso porque limita el uso de solventes tóxicos, produce rápidamente partículas en el rango de tamaño de 10-100 nm. A su vez, es uno de los métodos más comunes para preparar nanopartículas, la representación de este método se aprecia en la Figura 24 (Abu-thabit, 2021). Figura 24. Representación esquemática del método Emulsificación - Evaporación de solvente. Imagen propia. 41 6. COMPARACIONES DE TAMAÑO DE PARTÍCULAS, EFICIENCIA DE ENCAPSULACIÓN Y PRUEBAS DE EFICACIA. Después de la formación de los nanotransportadores, debe evaluarse su correcta formulación, y así asegurar una entrega eficiente del compuesto fenólico, entre estos parámetros se encuentran: El tamaño de partícula, la eficiencia de encapsulación y las pruebas de eficacia. Lo que finalmente garantiza una correcta incorporación y estabilidad en el sistema de entrega. En un nivel general, según la Tabla 3. Los factores que afectan los tamaños y eficiencia de encapsulación de las nanopartículas que encapsulan polifenoles son los siguientes: Los diferentes materiales de recubrimiento (Biopolímeros utilizados), la temperatura empleada, el surfactante y la concentración de este, la velocidad y tiempo de agitación, así como, la presión de este, en el caso de los métodos de fluido supercrítico. 42 Tabla 3. Efecto de distintos factores sobre el tamaño de partícula y la eficiencia de encapsulación (EE%) de nanoencapsulados polifenólicos. Factores que afectan Tamaño de Compuesto Técnica de Eficiencia de la EE% y Tamaño de partícula Referencia fenólico nanoencapsulación encapsulación (EE %) partícula (nm) Biopolímero Quercetina Nanoprecipitación PLA 94,80 - 99,40 193,70 - 181,90 (Wu et al., 2008) (Rachmawati et EGCG Fluido supercrítico PLA 59,31 - 89,42 146,60 - 225,73 al., 2016) (G. Singh & Pai, Resveratrol Nanoprecipitación PLGA 92,21- 93,52 168,00 - 170,00 2014) (Chen et al., Curcumina Fluido supercrítico Quitosano 73,80 - 99,80 371,40 - 378,00 2022) (Davidov & Resveratrol Emulsificación espontánea Alginato 89,00 - 92,00 140,00 - 180,00 McClements, 2015) Temperatura (°C) (Pandey et al., Quercetina Nanoprecipitación 20 - 35 56,00 - 61,00 52 - 51 2015) (Lévai et al., Quercetina Fluido supercrítico RESS 31 - 40 80,10 - 98,50 138 - 151 2017) (Radhakrishnan EGCG Evaporación de solvente 59 - 62 89,50 - 87,20 112,5 - 157,4 et al., 2016) 43 Factores que afectan Tamaño de Compuesto Técnica de Eficiencia de la EE% y Tamaño de partícula Referencia fenólico nanoencapsulación Encapsulación (EE %) partícula (nm) Presión (MPa) (Dal Magro et al., Resveratrol Fluido supercrítico RESS 8 - 15 99,54 - 56,81 440 - 554 2017) Fluido supercrítico Curcumina 10 - 20 94,00 - 36,00 81 - 68 (Xie et al., 2015) GAS (Ahmad et al., EGCG Fluido supercrítico RESS 30 - 35 65,25 - 36,87 261 - 892 2016) Velocidad de agitación y tiempo rpm min (Davidov & Composición de inversión de Resveratrol 700 5 82,00 – 92,00 106,00 – 208,00 McClements, fase 2015) Curcumina Evaporación de solvente 2,000 30 59,10 – 83,30 181,50 - 200,90 (Akl et al., 2016) Temperatura de inversión de (Date et al., Quercetina 1,200 20 91,30 – 93,30 403,00 – 408,40 fase 2011) Temperatura de inversión de (Weerapol et al., Curcumina 1,350 5 49,89 - 63,41 222,00 – 275,00 fase 2022) 44 Eficiencia de Tamaño de Compuesto Técnica de Factores que afectan la EE% y Tamaño de Encapsulación partícula Referencia fenólico nanoencapsulación partícula (EE %) (nm) SURFACTANTE CONCENTRACIÓN (%) (Davidov & Emulsificación 5 89,00 106,00 Resveratrol T- 80 McClements, espontanea 10 92,00 209,00 2015) Evaporación de 0,015 257,90 (Rachmawati et Curcumina TPGS ND solvente 0,06 260,23 al., 2016) Emulsificación 0,5 83,62 249,00 (Artiga-Artigas et Curcumina T-20 espontanea 2,0 85,74 276,00 al., 2018) T-80 8 94,66 Emulsificación (Shirazi et al., Quercetina T-20 10 95,88 ND espontanea 2012) RH40 12 96,44 PLA: Ácido poliláctico, PLGA: Poliácido-láctico-co-glicólico, MPa: Megapascal, rpm: Revoluciones por minuto, min: Minutos, nm: Nanómetro, T-80: Tween 80, T-20: Tween 20, TPGS: Succinato de polietilenglicol de tocoferilo, RH40: Aceite de ricino hidrogenado, ND: No disponible. 45 6.1 Tamaño de partícula Las nanopartículas y los dispositivos basados en estas son de amplio interés en aplicaciones industriales gracias a sus propiedades ventajosas, las cuales son debidas a la gran relación entre su superficie y volumen junto a los efectos que produce su tamaño pequeño, llevando a numerosos fenómenos dependientes de este, que afectan sus propiedades químicas, mecánicas, magnéticas y electrónicas. El tamaño tiene un papel esencial en la caracterización en las propiedades de los encapsulados. A nivel general, existen dos métodos básicos para la caracterización del tamaño de partículas. El primer método se trata de inspeccionar la partícula, realizando mediciones reales de sus dimensiones haciendo uso de las técnicas de microscopía, como son: La Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM), Microscopía de Fuerza Atómica (AFM), Microscopía Electrónica de Barrido (SEM), que miden parámetro de dimensiones partiendo de imágenes de estas. El segundo método se relaciona el comportamiento de las partículas y su tamaño (Akbari et al., 2011). Para determinar su tamaño y su distribución se pueden emplear varias técnicas como, por ejemplo: La distribución de luz dinámica (DLS), la cual, suele usarse para determinar el tamaño de las partículas. La microscopia se considera una herramienta muy útil, ya que, proporciona una evaluación precisa del tamaño y de la forma de una nanopartícula, aunque a menudo se requiere de pasos complicados en cuanto a la preparación de muestras en función de las técnicas del microscopio, lo que puede ocasionar cambios en dichas muestras y crear aglomeración de nanopartículas en el proceso de secado para microscopia electrónica. Además, gracias al rendimiento limitado se complica obtener la distribución del tamaño de las partículas (Cho et al., 2013). Otro método que se basa en imágenes es el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), tratándose de una técnica de seguimiento enfocada en una sola partícula, la cual, se basa en microscopía de campo oscuro o de fluorescencia y análisis autónomo de imágenes. En este método, el tamaño de partícula provine del desplazamiento promedio de las nanopartículas que presentan un movimiento browniano dentro de un marco de tiempo fijo. Una ventaja en este 46 método es que se encarga de rastrear las nanopartículas individuales, lo cual proporciona una alta resolución en muestras multimodales y agregaciones. Dado que estas técnicas se basan en diferentes principios físicos para la preparación de la muestra, los resultados varían según los métodos empleados, por ejemplo: La microscopía electrónica, DLS y NTA, dando lugar a resultados muy variables incluso para las nanopartículas homogéneas (Finder et al., 2004; Saveyn et al., 2010). A continuación, se observa en la Figura 25, el rango de tamaño de partícula que presentan comúnmente los sistemas de nanoencapsulación de polifenoles empleados en la industria cosmética según la tabla 2, (Nanoemulsiones, Nanopartículas Sólidas Lipídicas, Niosomas, Liposomas, Nanoesferas y Nanocápsulas), para cada sistema mencionado en la presente monografía. Figura 25. Rango de tamaños de partícula para cada sistema de nanoencapsulación de polifenoles. Nanoemulsiones Nanopartículas Sólidas Lipídicas Niosomas Liposomas Nanoesferas Nanocápsulas 0 50 100 150 200 250 300 350 Tamaño de partícula (nm) Imagen propia. 47 Sistemas de Nanoencapsulación Los tamaños de partículas para los diferentes sistemas de encapsulación de polifenoles pueden presentar distintas variaciones, como se muestra en la Figura 25. En esta se observa que al emplear sistemas como las nanocápsulas se pueden obtener tamaños comprendidos entre 10 y 100nm, en el caso de las nanoesferas se pueden obtener nanopartículas con tamaños entre 10 y 200nm. Por otro lado, los sistemas de nanoemulsiones se obtienen tamaños entre 20 y 200nm, en lo referente a las partículas solido-lipídicas y los liposomas los valores están entren 50 a 100nm y 50 a 200nm respectivamente, por último, los niosomas cuentan con los valores de tamaño de partícula más altos entre 90 a 300 nm, estos valores se dan debido a la relación que existe entre los sistemas de nanoencapsulación empleados y las técnicas utilizadas para la obtención de cada uno. Según la Tabla 3, el tamaño de las nanopartículas puede ser influenciado por el tipo de biopolímero que se utiliza para su recubrimiento. Como se evidencia, en los resultados obtenidos por Wu et al. (2008), en los que las nanopartículas que contenía quercetina formadas con PLA presentaron un tamaño de partícula entre 193,70 y 181,90 nm, mientras que los resultados obtenidos en la investigación de Davidov-Pardo & McClements (2015), donde se empleó alginato para la formación de nanopartículas conteniendo resveratrol se obtuvieron tamaños en un rango entre 140,0 y 180,0 nm. La temperatura es uno de los factores más importantes en relación al tamaño de partícula en la mayoría de las técnicas de nanoencapsulación, en los resultados expuestos por Radhakrishnan et al. (2016), se observó que en la formación de nanopartículas solido-lipídicas de EGCG, al emplearse una temperatura 59°C se logró un tamaño de 112,5 nm y al aumentar la temperatura a 62°C, el tamaño de las nanopartícula fue de 157,4 nm. Concluyendo que, al aumentar los valores de temperatura, también incrementaron los tamaños de partícula. Esto se debe a que la temperatura tiene un papel fundamental en la formación, morfología y estabilidad de los nanoencapsulados. En el caso particular de las técnicas de fluido supercrítico la presión es un factor influyente del tamaño de partícula, como se evidencia en el estudio realizado por 48 Dal Magro et al. (2017), en donde se encapsula resveratrol por medio del método de fluido supercrítico RESS, donde se variaron las presiones entre 8 y 15 Mpa resultando en la formación de nanopartículas con un rango de tamaño entre 440 a 554 nm, esto se debe a que el aumento de la presión conlleva a un aumento del tamaño de partícula. La velocidad y el tiempo de agitación son factores importantes para la producción de nanoencapsulados, principalmente con lo que respecta al tamaño de partícula. Esto se aprecia en los resultados mencionados por Weerapol et al. (2022). En esta investigación se nanoencapsuló curcumina por medio de la técnica de emulsificación por temperatura de inversión de fase, la velocidad utilizada fue de 1,350 rpm y el tiempo de agitación fue de 5 min, donde la variación de tamaño estuvieron entre 220,0 a 275,0 nm, mientras que en estudios realizados por Date et al. (2011), donde se encapsuló quercetina, empleando la misma técnica mencionada anteriormente, pero variando las condiciones de velocidad y tiempo de agitación a 1,200 rpm y 20 min, respectivamente. Los valores del tamaño de partícula variaron entre 403,0 y 408,40 nm, al comparar estos valores de tamaño obtenidos en los estudios anteriormente mencionados, se observa que, a mayor tiempo y menor velocidad de agitación, se presentó un aumento proporcional del tamaño de partícula. 6.2 Eficiencia de encapsulación El uso efectivo de nanopartículas como sistemas de administración de compuestos fenólicos en productos cosméticos se encuentra directamente relacionado con la eficiencia de encapsulación (EE%), Este parámetro se calcula a partir de la relación entre la cantidad de componte a ser encapsulado y la cantidad teórica o en disposición de ser encapsulado, a partir de la Ecuación 1 (Conte et al., 2016). Ecuación 1. Eficiencia de encapsulación (EE%). Cantidad de compuesto Fenólico Encapsulado EE% = X 100 Cantidad teórica de compuesto fenólico 49 En la Figura 26, se puede observar los diferentes porcentajes de eficiencia de encapsulación (EE%) para las técnicas mayormente empleadas en la nanoencapsulación de los compuestos polifenólicos utilizados en productos cosméticos. Se observa que las técnicas con las cuales se obtienen mayores EE son la emulsificación por temperatura de inversión de fase con un 97,5%. Seguida por, la nanoprecipitación, la emulsificación por evaporización de solvente y la emulsificación espontánea, estas presentan porcentajes de 97,0, 96,7 y 96,2% respectivamente. Finalmente se encuentran las técnicas con menor porcentaje de EE%, entre estas se encuentran la emulsificación por composición de inversión de fase con un 95% y las técnicas basadas en el uso de fluidos supercríticos, en caso del método GAS un 75% y para el método RESS un 60%. Figura 146. Porcentaje de Eficiencia de Encapsulación (EE%) para cada técnica de nanoencapsulación de polifenoles en cosmética. Fluido Supercrítico RESS 60,0 Fluido supercrítico GAS 75,0 Composición de Inversión de Fase 95,0 Temperatura de Inversión de Fase 97,5 Emulsificación Espontanea 96,2 Emulsificación Evaporización de solvente 96,7 Nanoprecitación 97,0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Porcentaje de encapsulación EE (%) 50 Técnicas de nanoencapsulación Según la Tabla 3, se puede observar la relación de las diferentes técnicas y materiales empleados en la nanoencapsulación sobre la EE%, en el caso de la nanoencapsulación de quercetina en nanopartículas sólido-lipídicas realizado por Wu et al. (2008), donde el rango de EE% fue bastante alto, entre 94,80 y 99,40%, esto gracias a la combinación de la técnica de nanoprecipitación y el empleo del material de recubrimiento PLA. Sin embargo, en otro estudio realizado por G. Singh & Pai. (2014), donde se empleó la técnica de nanoprecipitación los resultados de los porcentajes se ven afectados debido al uso de otro material como lo es el PLGA, dando como valores de eficiencia más bajo, que variaron entre un 92,21 a 93,52%. En cuanto a la temperatura es un factor que llega a influir en la eficiencia de encapsulación de los sistemas, observando que en el caso de las técnicas de nanoemulsificación, por ejemplo, en el estudio realizado por Radhakrishnan et al. (2016), sobre nanoencapsulación de EGCG con la técnica de evaporación de solvente, donde se manejaron temperaturas que rondaron entre los 59 y 62°C, las EE% estuvieron entre 89,50 y 87,20%. En comparación con otras técnicas, como en el caso de la investigación realizada por Pandey et al. (2015), la técnica empleada fue la nanoprecipitación para encapsular quercetina, las temperaturas oscilaron entre 20 y unos 35°C, y los valores de EE% rondaron entre 56,0 y 61,0%, mostrando que la eficiencia se ve disminuida, esto se debe a que la temperatura es determinante en la degradación de los polifenoles y la ruptura de los nanoencapsulados. Se pudo observar de acuerdo con ensayos realizados por Dal Magro et al. (2017), en los que se encapsuló resveratrol, por medio de la técnica de fluido super crítico RESS donde se utilizaron valores de presión entre 8 a 15 MPa que se obtuvieron eficiencias de encapsulación entre un 56,81 y 99,54%, donde el valor más alto de EE%, se obtuvo al usar un valor de presión de 15 Mpa. Comparando estos datos con los obtenidos por Ahmad et al. (2016) para la encapsulación de EGCG mediante la misma técnica, pero empleando valores de presión entre 30 y 35 MPa el rango de eficiencias de encapsulación varió entre 36,87 y 65,25 %, En este caso el valor de EE% más alto, se observó al emplear un valor de presión de 35 MPa. De acuerdo 51 con resultados y a las observaciones descritas de estos autores, se establece que la eficiencia de encapsulación se ve aumentada al incrementar la presión. Por otro lado, en los ensayos realizados por Date et al. (2011), para la nanoencapsulación de quercetina mediante la técnica de temperatura de inversión de fase, en la que se manejó una velocidad de agitación de 1,200 rpm, se obtuvieron valores de eficiencia de encapsulación de 91,30 a 93,30%. Al establecer una comparación entre dicha investigación y el trabajo realizado por Weerapol et al. (2022), en el cual, se estudió la nanoencapsulación de curcumina mediante la misma técnica manejando una velocidad de agitación de 1,350 rpm, se presentaron EE% entre 49,89 y 63,41 %, mostrando un descenso en la eficiencia de encapsulación al incrementar la velocidad de agitación. Finalmente, se observa el efecto de la concentración de surfactante en los valores de eficiencia mediante ensayos realizadas por Davidov & McClements. (2015), en donde se realiza la encapsulación de resveratrol por medio de emulsificación espontánea, empleando como surfactante Tween 80 al 5% y al 10%, obteniendo eficiencias de encapsulación de 89,00 y 92,00 %, respectivamente. En los cuales se pudo apreciar una disminución en los valores de eficiencia de encapsulación de manera proporcional a la disminución de las concentraciones de surfactante. 6.3 Pruebas de eficacia Los productos cosméticos deben tener eficacia comprobada en combinación con una evaluación toxicológica integral. Estos requerimientos legales están dados bajo el Reglamento Europeo de Cosméticos N° 1223 de 2009 del Parlamento Europeo y Del Consejo y el Reglamento específico N° 655 de 2013 de la Comisión Europea, establecen entonces los datos necesarios para demostrar la seguridad y respaldar las afirmaciones o proclamas que utilicen sobre las diversas actividades cosméticas que sugieren los productos de los diversos laboratorios cosméticos. En la actualidad se han desarrollado y validado una gran variedad de pruebas de seguridad y eficacia de cosméticos, empleándose mayormente pruebas in vitro (Barthe et al., 2021). 52 Existen una gran variedad de estudios de eficacia para productos cosméticos nanoencapsulados con polifenoles, estas pruebas son enfocadas en la evaluación de una actividad o capacidad específica que brinda el compuesto fenólico, como son la actividad antioxidante, antienvejecimiento y la fotoprotección. Finalmente, los ensayos más empleados para la evaluación de la eficacia para estas actividades, se encuentran: La prueba de porcentaje de Inhibición de enzima anti-colagenasa y anti-elastasa, el método de DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo), la prueba de capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC), la prueba de factor de protección Solar (SPF) in vitro e in vivo y la evaluación in vitro del factor de protección UV-A (UV-A PF). 6.3.1 Actividad antienvejecimiento Inhibición de la enzima anti-colagenasa y anti-elastasa Los dos tipos distintos de envejecimiento que existen pueden deberse a la herencia genética o al envejecimiento extrínseco o externo, como el fotoenvejecimiento. Sin embargo, una consecuencia de ambos es la producción de radicales libres a los cuales atribuye la pérdida de elasticidad de la piel, una de las características clásicas del envejecimiento. Por otro lado, La elastina una proteína dérmica que es un componente del tejido conectivo, contribuye principalmente a la elasticidad de la piel y con el tiempo el metabolismo de las proteínas del tejido conectivo se ralentiza acompañado de un aumento de la actividad enzimática, en particular de la elastasa, que descompone la elastina. Una forma de prevenir esta pérdida de elasticidad es utilizar principios activos que sean capaces de inhibir estas enzimas (Aguilar & Liceaga, 2020; Mathen et al., 2015). Se ha demostrado que los extractos fenólicos inhiben la actividad de las proteinasas, que catalizan la degradación de las proteínas de la piel, como el colágeno y la elastina. El colágeno en la dermis es responsable de la firmeza y las fibras de elastina de la elasticidad. La formación excesiva de radicales libres induce la expresión de colagenasa y elastasa, lo que conduce a una rápida degradación de las respectivas proteínas. La técnica empleada para la realización de estas pruebas 53 se basa en la espectrofotométrica, por medio de un lector de microplacas de absorbancia - Espectrofotómetro UV/Vis. Para la evaluación de la eficacia en este caso, se realiza por medio del cálculo de porcentaje de inhibición de elastasa y colagenasa como se observa en la Ecuación 2 (Mandrone et al., 2015; Oresajo et al., 2012). Ecuación 2. Cálculo porcentaje de inhibición de elastasa. fluorescencia de la muestra % 𝐼nhibición de elastasa = 1 − ( ) 𝑋 100* fluorescencia de la muestra control * Se realiza la misma operación para el porcentaje de inhibición de la colagenasa. 6.3.2 Actividad antioxidante ➢ Método DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) Es el método más ampliamente empleado para la detección de la actividad antioxidante. El DPPH es un radical estable con un color púrpura intenso. La reacción con otros radicales, electrones o átomos de hidrógeno provoca la pérdida de color a una longitud de onda de 515 nm y la pérdida de la señal de radicales libres. Para este método es empleado el cálculo del porcentaje de inhibición del radical DPPH, descrito a continuación en la Ecuación 3 (Schaich et al., 2015). Ecuación 3. Cálculo porcentaje de inhibición del radical DPPH. Absorbancia de muestra control % Inhibición del radical DPPH = 1 − ( ) 𝑋 100 Absorbancia de la muestra ➢ Capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC) El método ORAC se puede utilizar para comprobar el poder antioxidante total de diversas formulaciones y actualmente es uno de los métodos más utilizados. Este calcula la capacidad de un producto para proteger contra los radicales libres potencialmente dañinos. El método consiste en evaluar la degradación oxidativa de una molécula fluorescente en presencia de iniciadores de radicales libres como los azocompuestos AAPH (2,2’-azo-bis(2-amidino-propano) dihidrocloruro. El AAPH se 54 utiliza como radial iniciador, que por descomposición térmica origina radiales peroxilo que causan degradación de las moléculas fluorescentes. Este método mide la disminución de la fluorescencia debida a la acción de radicales peroxilo. La actividad antioxidante de la muestra se mide en relación con la sustancia de referencia que es un análogo de la vitamina E hidrosoluble (Trolox), el cálculo de ORAC, se realiza mediante la Ecuación 4 y 5 (Amorati & Valgimigli, 2015; Oresajo et al., 2012). Ecuación 4. Cálculo obtención del área bajo la curva a partir de los datos de fluorescencia relativa. 𝑓𝑛 𝐴𝑈𝐶 = [0,5 + ∑ ] x 5 𝑓1 Donde: fn es la lectura de la fluorescencia en tiempo n y f1 es la primera lectura de fluorescencia en tiempo cero. Con estos datos se puede comparar a la capacidad antioxidante entre concentraciones de una misma muestra. Ecuación 5. Cálculo obtención de equivalentes Trolox (AUC muestra − AUCblanco)k Equivalentes Trolox = (AUC rolox − AUCblanco) Donde: Ctrolox es concentración de Trolox en μM, k es el factor de dilución de la muestra y (AUCmuestra, AUCtrolox y AUCblanco) el área bajo la curva de la muestra, trolox y blanco respectivamente. 6.3.3 Actividad fotoprotectora ➢ Prueba de factor de protección Solar in vitro (SPF in vitro) El factor de protección solar (SPF) se utiliza como indicador universal para dar información sobre la capacidad de un producto para reducir el eritema solar inducido por los rayos UV. El método in vitro permite resaltar el papel de filtro UV de sustancias tanto inorgánicas como orgánicas, que posteriormente podrían incorporarse a una formulación de fotoprotectora de aplicación tópica. El 55 rendimiento de protección absoluta de un producto de protección solar contra la radiación UV o eritérmica efectiva, es calculado a partir de la transmitancia in vitro medida y ponderada con el espectro de acción del eritema y con el espectro de salida estándar de un simulador solar UV utilizado para la prueba de SPF, como se observa en la Ecuación 6 (Donglikar & Deore, 2016). Ecuación 6. Cálculo factor de protección solar método in vitro. ∑400290 𝐸𝜆𝐵𝜆 SPF = ∑400 290 𝐸𝜆𝐵𝜆/𝑀𝑃𝐷𝜆 Donde: Eλ representa la irradiancia espectral de la luz solar terrestre bajo condiciones definidas; Bλ es la efectividad eritemática relativa; MPDλ es el factor de protección monocromático en cada longitud de onda. Los límites de integración de longitud de onda corresponden al rango de longitud de onda combinado de UV-B y UV-A de (290–400 nm). Los valores de SPF correspondientes a los rangos UV-B (290–320 nm) y los de UV-A (320–400 nm). ➢ Prueba de factor de protección Solar (SPF In vivo): El procedimiento es simplemente, se determina la Dosis Mínima de Eritema (MED) en al menos 20 pero no más de 25 sujetos calificados. La MED es la cantidad de radiación ultravioleta requerida para producir la primera reacción de enrojecimiento perceptible con bordes claramente definidos entre 22 y 24 horas después de la irradiación con y sin protección solar. Se calcula mediante la Ecuación 7 (Donglikar & Deore, 2016). Ecuación 7. Cálculo factor de protección solar método in vivo. MED con protector solar SPF = MED sin proteción solar Donde: MED es la dosis mínima de eritema de luz solar para inducir eritema (quemadura solar). ➢ Factor de protección UVA in vitro (UV-A PF in vitro): 56 La protección UV-A absoluta que ofrece un producto solar, es calculada a partir de la transmitancia in vitro medida después de la irradiación y ponderada con el espectro de acción del eritema y con el espectro de salida estándar de un simulador solar con filtro UV-A SPF, este cálculo se observa en la Ecuación 8 (Donglikar & Deore, 2016). Ecuación 8. Cálculo factor de protección UV-A in vitro. ∑400320 𝐸𝜆𝐵𝜆 UV-A PF = ∑400320 𝐸𝜆𝐵𝜆/𝑀𝑃𝐷𝜆 Donde: Eλ representa la irradiancia espectral de la luz solar terrestre bajo condiciones definidas; Bλ es la efectividad eritemática relativa; MPDλ es el factor de protección monocromático en cada longitud de onda. Los límites de integración de longitud de onda corresponden, al rango de longitud de onda de UV-A (320–400 nm). Según la Tabla 4, las pruebas mayormente utilizadas para determinar actividad antioxidante de los polifenoles nanoencapsulados, son los ensayos de eliminación de radicales DPPH, así, como los ensayos de eliminación de radicales ORAC. Respecto a las pruebas de fotoprotección, se emplean los métodos UV-A PF y el método SPF y finalmente al evaluar la eficacia de la actividad antienvejecimiento, las pruebas de inhibición de las enzimas colagenasa y elastasa, son los estudios de gran relevancia debido a que estas enzimas son marcadores de signos de envejecimiento, tales como, la pérdida de elasticidad y firmeza de la piel. 57 Tabla 4. Pruebas de eficacia realizadas a diferentes compuestos fenólicos nanoencapsulados en la industria cosmética. Sistema de Actividad Prueba de eficacia Polifenol Resultados Referencia nanoencapsulación cosmética antioxidante Porcentaje inhibición Ensayo de eliminación de (Hashim et al., Curcumina Nanoemulsión Antioxidante DPPH = 70% radicales DPPH 2019) Ensayo de eliminación de (Maqsoudlou et Quercetina Nanoesfera Antioxidante ORAC = 525,00 μM radicales ORAC al., 2020) Factor de protección UV-A (Polonini et al., Resveratrol Nanoemulsión Fotoprotección UV-A PF = 9,00 (UV-A PF) 2013) Factor de protección solar Pre-irradiación SPF = 9,88 (Jarzycka et al., Curcumina Nanoemulsión Fotoprotección (SPF) Post-irradiación SPF = 7,80 2013) Antienvejecimient Inhibición de enzima Porcentaje Inhibición = (Ferreira et al., Resveratrol Nanoemulsión o elastasa 70% 2021) Antienvejecimient Inhibición de enzima Porcentaje Inhibición = (Montenegro, Curcumina Nanoemulsión o colagenasa 60% 2014) DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazy, ORAC: Capacidad de absorbancia de radicales de oxígeno, μM: micro molar, AAPH: (2,2’- azo-bis(2-amidino-propano) dihidrocloruro, UV-A PF: Factor de protección UV-A, SPF: Factor de protección solar. 58 Los resultados expuesto por Hashim et al. (2019) donde la Curcumina mostró un porcentaje de la actividad de eliminación de radicales alrededor del 70%, reveló que tiene propiedades antioxidantes altas, esto debido a que la nanoencapsulación mejora su estabilidad, su efectividad y eficacia. Por otro lado, en la evaluación de la capacidad antioxidante de la quercetina determinada a través de la metodología ORAC realiza por Maqsoudlou et al. (2020), demostró que la quercetina tiene gran capacidad de disminución de radicales peroxilo. Los valores de UV-A PF in vitro para las composiciones estudiadas por Polonini et al. (2013), fueron muy superiores al valor mínimo recomendado, que debería ser al menos 2,0. Abarcando un rango de longitud de onda de 376,5 a 387,0nm, para todas las emulsiones de protección solar estudiadas, cumpliendo con los requisitos mínimos de al menos 370 nm de la longitud de onda crítica. Estudios sobre el resveratrol donde se evalúa la actividad antienvejecimiento, realizados por Ferreira et al. (2021), así como, ensayos realizados por Montenegro (2014) Se observo, la eficacia del resveratrol para inhibir las enzimas colagenasa y elastasa, ralentizando las arrugas que se producen debido a la degradación del colágeno y la elastina. Los valores de anti-elastasa y anti-colagenasa observados en la Tabla 4, son de gran importancia, ya que, en ambas investigaciones se demostraron buenas actividades inhibidoras de estas enzimas. 59 7. CONCLUSIONES Los polifenoles son metabolitos activos sintetizados por plantas, que presentan una gran variedad de actividades biológicas, químicas y fisiológicas. Sin embargo, en su forma libre presentan limitaciones en su estabilidad, además de poseer una solubilidad limitada en agua, esto conlleva a una pérdida considerable de su actividad. Por lo tanto, la nanoencapsulación se convierte en una herramienta protectora, capaz de mantener estabilidad de polifenol hasta su administración. Las diversas investigaciones mencionadas en esta monografía revelaron que la nanoencapsulación fisicoquímica proporcionó una protección significativa contra condiciones drásticas como la oxidación y la degradación térmica, contribuyendo así, al aumento la vida útil de los ingredientes activos. Además, las nanopartículas también pueden controlar la liberación, cambiar las propiedades físicas del material inicial y mejorar la biodisponibilidad del compuesto polifenólico. La revisión bibliográfica, permite observar que las técnicas más usadas para nanoencapsular polifenoles son: La nanoprecipitación, las técnicas de fluidos supercrítico, la emulsificación espontánea, la emulsificación por evaporización de solvente, así como, las técnicas de inversión de fase. Los materiales de recubrimiento empleados en mayor proporción son los biopolímeros o polímeros naturales gracias a que son biodegradables y presentan mayor seguridad en productos cosméticos de aplicación tópica, como en protectores solares, o emulsiones con propiedades antioxidantes o antienvejecimiento. Por otro lado, los nanoencapsulados polifenólicos, presentan diferentes pruebas o evaluaciones para demostrar su eficacia y eficiencia para su uso en cosméticos, en las que se evalúa la eficiencia de encapsulación, el tamaño de partícula y la realización de pruebas de eficacia para las diversas actividades cosméticas que presente el polifenol. Así mismo, existen factores que pueden afectar los resultados tanto de la EE%, como el tamaño de partícula, como son: Los biopolímeros utilizados para recubrimiento, la temperatura empleada, el surfactante y la 60 concentración de este, la velocidad y tiempo de agitación, así como, la presión en el caso específico de los métodos de fluido supercrítico. Finalmente, existe una gama amplia de pruebas de eficacia para los productos cosméticos de nanoencapsulados fenólicos, que presentas actividades antioxidante, antienvejecimiento y actividad fotoprotectora. Empleando mayoritariamente pruebas tales como: El método de DPPH, la prueba de capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC), la prueba de porcentaje de Inhibición de enzima anti-colagenasa y anti-elastasa, por último, las pruebas de SPF y UV-A PF. 61 8. RECOMENDACIONES Ampliar la investigación sobre los diferentes polifenoles empleados como excipientes para mejorar la estabilidad de formulaciones cosméticas, aprovechando sus actividades antioxidantes y antimicrobiana, con el objetivo de complementar lo descrito en la presente monografía. Realizar una búsqueda profunda acerca de pruebas innovadoras de eficacia en productos polifenólicos nanoencapsulados de aplicación cosmética, con actividades antienvejecimiento y fotoprotectora, que permitan generar nuevas alternativas que garanticen mayor precisión en los resultados de las pruebas de eficacia. Hacer una revisión de artículos que permita ampliar las investigaciones sobre los diversos sistemas de nanoencapsulación de polifenoles, implementando la promoción de aplicaciones novedosas de estos productos en la industria farmacéutica, con un enfoque sobre sus actividades terapéuticas (Anticancerígena, antialérgicas y antiinflamatorias). 62 9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abu-thabit, N. 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